水牛胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)染的初步研究.pdf

1、本研究以水牛胎兒四肢長骨骨髓為分離對象，采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)水牛胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，首先比較了不同胎兒大小和不同血清濃度對水牛胎兒BMSCs增殖效果和分化情況的影響，并對所分離得到的細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定;同時探討了水牛胎兒BMSCs分別培養(yǎng)在常氧條件(20％O2)和低氧條件(5％O2)下細(xì)胞表面抗原、間質(zhì)標(biāo)記基因、應(yīng)力纖維和核型的變化情況;另外，

2、還比較了水牛胎兒BMSCs和水牛胎兒成纖維細(xì)胞(BFFs)用不同轉(zhuǎn)染試劑對其轉(zhuǎn)染效果的影響，以期建立一套穩(wěn)定的水牛胎兒BMSCs分離培養(yǎng)體系和高效轉(zhuǎn)染外源基因的方法。研究結(jié)果如下:
　　(1)隨著培養(yǎng)基中血清濃度的增加，細(xì)胞增殖速度加快;細(xì)胞周期檢測試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)15％血清濃度中處于G0/G1期的細(xì)胞比例最小(35.8％vs52.4％，P＜0.01;35.8％vs51.6％，P＜0.01)，10％血清濃度和20％血清濃度的差異不顯著（5

3、2.4％vs51.6％，P＞0.05）;但從細(xì)胞形態(tài)來看隨著血清濃度的增加，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)鈣沉積的細(xì)胞數(shù)量也隨之增多。分離自不同大小胎牛的水牛胎兒BMSCs培養(yǎng)在10％血清濃度的培養(yǎng)基中，細(xì)胞形態(tài)無明顯區(qū)別均與典型的MSCs細(xì)胞形態(tài)相似。細(xì)胞生長曲線均成“S”型，增殖速率與細(xì)胞代數(shù)和胎牛大小有關(guān):10cm以下的水牛胎兒不易分離得到其骨髓，10cm～17cm的胎牛來源的BMSCs在3代以內(nèi)隨著代數(shù)的增加增殖速度加快，傳至4代后，其增殖速度隨著

4、代數(shù)的增加而下降;17cm以上胎牛來源的BMSCs其增殖速率，第2代高于第1代細(xì)胞，第3代開始下降且低于第1代細(xì)胞。
　　(2)對所分離得到的水牛胎兒BMSCs進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定發(fā)現(xiàn):RT-PCR檢測到第3代細(xì)胞表達(dá)oct4、sox2、nanog等多能因子和CD73、CD90、CD105等細(xì)胞表面抗原。免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)第3代細(xì)胞表達(dá)OCT4、Nanog和CD73。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示:第3代、第5代、第10代、第15代和第20代

5、細(xì)胞的CD29和CD44的陽性率均大于95％，造血干細(xì)胞表面抗原CD45和內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原CD31的陽性率均小于2％。體外誘導(dǎo)分化試驗(yàn)表明第3代細(xì)胞可以被定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞。
　　(3)在常氧培養(yǎng)條件下，水牛胎兒BMSCs隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，CD29+陽性細(xì)胞比例逐漸下降;細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力纖維合成受阻，細(xì)胞形態(tài)由梭形逐漸轉(zhuǎn)變成多邊型;培養(yǎng)至10代后，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記(mesenchymal marker)基因:snail、sl

6、ug、fn1、N-Cadhering mRNA的表達(dá)水平下降。然而，在低氧培養(yǎng)條件下，免疫熒光染色結(jié)果顯示:細(xì)胞內(nèi)的低氧誘導(dǎo)因子1、2(HIF-1、HIF-2)的表達(dá)被激活，其下游基因twist的表達(dá)量亦隨之升高，與此同時間質(zhì)標(biāo)記基因snail、slug、fn1、N-Cadhering、col1a的表達(dá)量亦隨之升高;細(xì)胞黏附試驗(yàn)表明，低氧條件下細(xì)胞的黏附性較于常氧條件下更小，更具有間質(zhì)細(xì)胞特性;細(xì)胞免疫熒光染色亦表明:在低氧條件下，水牛

7、胎兒BMSCs的應(yīng)力纖維較在常氧下合成更穩(wěn)定，表達(dá)量更高。培養(yǎng)于低氧條件下的P3、P10和P20水牛胎兒BMSCs核型分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明隨著細(xì)胞代數(shù)的增加，核型正常率下降，培養(yǎng)于低氧條件下的P10、P20細(xì)胞核型正常率高于常氧條件下的
　　(4)在轉(zhuǎn)染試劑相同的情況下，相同代數(shù)的水牛胎兒BMSCs轉(zhuǎn)染效率顯著高于BFFs(15.6％±0.17＞13.3％±0.13，P＜0.05;23.9％±0.21＞19.1％±0.22，P＜0.0

8、5);轉(zhuǎn)染同一種細(xì)胞的情況下，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000的轉(zhuǎn)染效率顯著高于Roche(R) X-tremegene（19.1％±0.22＞13.3％±0.13, P＜0.05;23.9％0.21＞15.6％±0.17，P＜0.05）。在此基礎(chǔ)上利用LipofectamineTM3000將帶有催乳素(PRL)基因的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染了相同代數(shù)的水牛胎兒BMSCs和BFFs，水牛胎)BMSCs轉(zhuǎn)染效率同樣顯著高于BFFs（18

9、.5％±0.19＞16.4％±0.14，P＜0.05）;PCR檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有PRL基因整合。
　　結(jié)論:(1)從10～17cm長的水牛胎兒長骨分離的骨髓利用全骨髓貼壁法可以分離得到具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性的BMSCs;(2)水牛胎兒BMSCs在10％的血清濃度和低氧(5％O2)條件下體外培養(yǎng)，細(xì)胞中HIF-Twist軸被激活，其下游靶基因snail、slug、N-Cadherin、fn1和col1a1表達(dá)量升高，從而有助于B