抑制血管平滑肌細胞增殖相關(guān)基因的篩選克隆定位與功能研究.pdf

1、一、研究背景與目的心血管病是嚴(yán)重危害人類健康的第一殺手。血管平滑肌細胞(Vascularsmoothmusclecell，VSMC)增殖和遷移是經(jīng)皮冠脈腔內(nèi)血管成形術(shù)(percutaneoustransluminalcoronaryangioplast，PTCA)及支架植入術(shù)后再狹窄、動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，As)、高血壓等疾病的病理基礎(chǔ)之一，抗增殖治療是目前心血管領(lǐng)域研究的熱點。本研究以血管平滑肌細胞為研究對象，

2、以大豆甙元為(daidzein，Da)工具藥，以大豆甙元抑制血管平滑肌細胞增殖的相關(guān)基因為切入點，尋找能夠抑制血管損傷后內(nèi)膜VSMC過度增殖的基因及其編碼蛋白，并探討其作用機制，以期為心血管疾病的防治提供理論和實驗依據(jù)。 二、材料與方法1.體外細胞實驗確定大豆甙元對血管平滑肌細胞增殖抑制作用的最佳藥物作用濃度及時間，DD-PCR差異篩選大豆甙元抑制VSMC增殖的相關(guān)基因。 2.篩選出的EST(expressionsequ

3、encetag)進行同源性、結(jié)構(gòu)域分析，競爭性反轉(zhuǎn)錄PCR驗證，確定藥物誘導(dǎo)效果最明顯的cDNA片段。 3.復(fù)制大鼠頸動脈球囊損傷動物模型，損傷當(dāng)天起每日清晨給大鼠腹腔內(nèi)注射大豆甙元干預(yù)(200μM/kg/d)，對照組給予同體積溶劑，每組各8只。給藥5周后病理切片、血清生化指標(biāo)分析，并對大鼠頸動脈球囊損傷后的病理切片進行基因表達的組織定位。 4.根據(jù)驗證陽性的基因編碼序列獲得編碼區(qū)eDNA連接于表達載體pET32a，構(gòu)建

4、表達重組子，轉(zhuǎn)化入Origami(DE3)，誘導(dǎo)蛋白表達、酶切、純化并鑒定。蛋白純化后免疫家兔，提取多克隆抗體，對雌激素和大豆甙元刺激后的細胞爬片進行免疫組化進行細胞定位、病理切片的組織定位。 5.采用Boyden小室法測定蛋白和大豆甙元對細胞遷移的作用，并測定蛋白對細胞活性的影響，并分析經(jīng)蛋白刺激后細胞周期的變化。 6.不同來源的血管平滑肌細胞給予藥物刺激及拮抗劑阻斷，競爭性反轉(zhuǎn)錄PCR、NorthernBlot、原位

5、雜交驗證探討大豆甙元誘導(dǎo)目的基因表達的作用途徑。 三、結(jié)果1.差異篩選相關(guān)基因：體外細胞實驗顯示1x10-6M～1x10-4MDa作用24h可顯著抑制人臍動脈平滑肌細胞增殖。以溶劑對照、1x10-6MDa和2.5x10-5MDa刺激細胞后進行DD-PCR分析。結(jié)果顯示11個EST片段于高濃度組 (2.5x10-5MDa)強，低濃度組(1x10-6M)弱，對照組最弱；4個EST片段低濃度組強，高濃度組弱，對照組最弱4個ES

6、T片段對照組強，低濃度組弱，而高濃度組最弱的片段。 2.體外驗證與同源分析：競爭性反轉(zhuǎn)錄PCR證實了Da對有3個編碼奢侈基因克隆(H3A、H6A和C2B)的誘導(dǎo)作用，其中大豆甙元對H3A的誘導(dǎo)作用最強。H3A序列與名為FSTL1的基因相似性為100％；H6A序列與KIAA0663的基因相似性為86％；C2B序列與KIAA1265的基因相似性為94％。 3.目的基因體內(nèi)驗證：大豆甙元干預(yù)后可顯著抑制球囊損傷后的內(nèi)膜增殖，病

7、理圖像分析：與溶劑對照組相比，治療組管腔面積顯著增加(244108±17651vs69157±20708μm2，P＜0.05，)，內(nèi)膜面積顯著減少(147651±119473vs234370±125691μm2，P＜0.05)。病理切片原位雜交結(jié)果顯示藥物治療后，H3A表達于新增的內(nèi)膜。 4.目的蛋白的定位：細胞爬片免疫組化顯示，經(jīng)雌激素或大豆甙元刺激后VSMC可表達H3A蛋白，該蛋白位于胞內(nèi)，且于“成峰狀”的細胞團表達顯著多于

8、散在單個細胞。病理切片免疫組化結(jié)果顯示，藥物治療后，H3A蛋白主要表達于新增的內(nèi)膜。 5.目的蛋白功能探討：10ng/ml、50ng/ml和100ng/ml的H3A蛋白可抑制VSMC的增殖；50ng/ml和100ng/mlH3A可抑制VSMC遷移。100ng/mlH3A蛋白刺激后細胞停留在G2期的數(shù)目增加明顯，且并未出現(xiàn)凋亡。 6.藥物誘導(dǎo)目的基因表達的機制探討：大豆甙元可與雌激素受體α和/或β結(jié)合，特異性誘導(dǎo)H3A于血

9、管平滑肌表達，該作用可被雌激素受體拮抗劑阻斷，推測雌激素受體只作為輔助轉(zhuǎn)錄因子參與H3A誘導(dǎo)表達。 四、結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)并證實了一個大豆甙元抑制VSMC增殖過程中誘導(dǎo)表達的基因為H3A。激活的雌激素受體可誘導(dǎo)該基因于VSMC中表達；并證實在大鼠頸動脈球囊損傷模型的藥物干預(yù)組中，內(nèi)膜特異性地表達H3A增加，提示該基因可能具有抑制內(nèi)膜增殖的作用。該基因編碼蛋白經(jīng)藥物刺激后VSMC表達增加，陽性顆粒主要位于呈“峰狀”的細胞團中，且也位于