CaMEK基因靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)減輕老齡心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制研究.pdf

1、目的:本研究旨在探討年齡因素對(duì)缺血后適應(yīng)心肌保護(hù)作用的影響，研究老齡缺血后適應(yīng)心肌保護(hù)作用消失的分子機(jī)制;通過(guò)研究巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子與雞β-肌動(dòng)蛋白(CBA)啟動(dòng)子重組AAV9載體的組織表達(dá)特異性，篩選獲得較好的可用于心臟疾病基因治療的AAV9載體;并使用攜帶CaMEK(CaMEK)基因的重組AAV9載體，靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)老齡小鼠心臟，探討外源導(dǎo)入CaMEK能否作為基因治療藥物，具有靶向激活ERK1/2通路，減少心肌梗死、抑制心肌細(xì)胞凋

2、亡、防治老齡心肌缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制。本研究包括:①應(yīng)用小鼠Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)，對(duì)比研究缺血后適應(yīng)對(duì)年輕與老齡小鼠心肌保護(hù)作用的差異，闡明缺血后適應(yīng)心肌保護(hù)作用年齡異質(zhì)性的分子機(jī)制。②通過(guò)體內(nèi)外轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，對(duì)比研究桿狀病毒載體系統(tǒng)包裝制備的CMV與CBA啟動(dòng)子的重組AAV9載體介導(dǎo)GFP基因在小鼠體內(nèi)的組織表達(dá)特異性、表達(dá)時(shí)間點(diǎn)、安全性，篩選更適宜用于心臟疾病基因治療的重組AAV9載體。③靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)CaMEK基因至

3、老齡小鼠心肌，通過(guò)離體及在體心肌缺血再灌注模型，探討CaMEK基因過(guò)表達(dá)減輕老齡心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。
　　方法:
　　第一部分:選取3～4月齡和15～18月齡的雄性C57BL/6J小鼠，建立Langendorff離體心臟缺血后適應(yīng)模型，離體再灌注(IR)心臟經(jīng)受45 min全心缺血和60 min再灌注，缺血后適應(yīng)(IPost)于再灌注即刻給予3個(gè)循環(huán)10s缺血+10s再灌注的IPost處理，同時(shí)年輕小鼠給予PD98

4、059（ERK1/2抑制劑）。觀測(cè)指標(biāo)為心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡、p-ERK1/2、p-P70S6K及p-AKT的表達(dá)。
　　第二部分:將劑量為1×1011vg的AAV9-CMV-eGFP及AAV9-CBA-eGFP載體分別經(jīng)尾靜脈注射導(dǎo)入C57BL/6小鼠體內(nèi)，于病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)0周、1周、2周、3周、4周、5周和8周，利用激光共聚焦和Western Blot檢測(cè)心、肝、脾、肺、腎、腦及骨骼肌中GFP蛋白表達(dá);通過(guò)q-PCR檢測(cè)A

5、AV9載體在不同組織中的拷貝數(shù)，研究AAV9病毒顆粒的體內(nèi)分布與存在時(shí)間，系統(tǒng)評(píng)價(jià)CMV與CBA啟動(dòng)子重組AAV9載體的組織靶向性;通過(guò)檢測(cè)心肌酶、肝功及腎功能指標(biāo)，評(píng)價(jià)AAV9載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的安全性。在細(xì)胞水平上，利用原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞及BRL-3A大鼠肝細(xì)胞株，分別以不同感染復(fù)數(shù)(MOI=105、106、107)的AAV9-CMV-eGFP及AAV9-CBA-eGFP載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀測(cè)定AAV9載體的體外轉(zhuǎn)染效

6、率，同時(shí)采用TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞的凋亡率。
　　第三部分:選取15～18月老齡雄性C57BL/6J小鼠，分別經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水，AAV9-CMV-eGFP和AAV9-CMV-CaMEK，5周后采用Western Blot法檢測(cè)心肌中MEK、p-ERK1/2、p-P90RSK的表達(dá);并于病毒轉(zhuǎn)染5周后，采用Langendorff離體心臟灌流模型及小鼠在體缺血再灌注損傷模型，離體心臟處理同第一部分;在體心臟經(jīng)受60 m

7、in局部缺血和24 h再灌注，觀察指標(biāo)為心肌梗死面積、細(xì)胞凋亡，心肌酶CK、CK-MB、LDH，Bcl-2、Bax的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　第一部分:①與直接缺血再灌注相比，缺血后適應(yīng)可使年輕小鼠心肌的梗死面積顯著降低（39.7±4.6％ vs24.9±2.9％，P＜0.01）;且心肌細(xì)胞凋亡亦顯著下降（12.2±1.8％vs7.7±1.3％，P＜0.01）。②缺血后適應(yīng)對(duì)老齡小鼠心肌沒(méi)有保護(hù)作用，IR組和IPost組的心肌

8、梗死面積為(49.5±7.5％ vs47.5±7.3％，P＞0.05)，心肌細(xì)胞凋亡率為（13.5±2.3％ vs13.7±2.4％，P＞0.05），且老齡組小鼠心肌梗死面積顯著高于年輕組（P＜0.01）。③缺血后適應(yīng)通過(guò)再灌注早期誘導(dǎo)年輕小鼠心肌p-ERK1/2、p-P70S6K表達(dá)的增加，但是對(duì)老齡小鼠心肌卻沒(méi)有這項(xiàng)效應(yīng)，使用ERK1/2特異性抑制劑PD98059使缺血后適應(yīng)對(duì)年輕小鼠心肌的保護(hù)作用完全消失，同時(shí)缺血后適應(yīng)均未誘導(dǎo)年

9、輕和老齡小鼠心肌p-AKT表達(dá)的增加。
　　第二部分:①激光共聚焦和Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CMV與CBA重組AAV9載體轉(zhuǎn)導(dǎo)5周時(shí)，GFP蛋白主要在小鼠心肌和肝臟中表達(dá)，而脾、肺、腎、腦及骨骼肌中幾乎未見(jiàn)表達(dá)。②各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)CMV啟動(dòng)子所介導(dǎo)的GFP蛋白在心肌中的表達(dá)顯著高于肝臟。AAV9載體轉(zhuǎn)導(dǎo)1周后心肌和肝臟中開(kāi)始表達(dá)GFP蛋白，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)逐漸增強(qiáng)，轉(zhuǎn)導(dǎo)第5周到達(dá)高峰，其在心臟和肝臟轉(zhuǎn)染效率84.0±3.2％

10、vs23.6±3.4％，(P＜0.01)，第8周時(shí)為75.0±3.5％ vs2.2±0.3％，(P＜0.01)，表明AAV9-CMV-eGFP載體對(duì)心肌有極強(qiáng)的靶向親和力，可在心肌中長(zhǎng)期穩(wěn)定的高效表達(dá)，但CMV啟動(dòng)子活性在肝臟中很容易被沉默。③AAV9-CBA-eGFP載體有極強(qiáng)的嗜肝性，各觀察點(diǎn)其在肝臟中的表達(dá)顯著高于心肌，亦隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，5周時(shí)表達(dá)至高峰，此時(shí)肝臟和心臟的轉(zhuǎn)染效率88.0±3.9％ vs7.7±0.7％，(P

11、＜0.01)，第8周時(shí)為84.4±2.4％ vs6.4±0.4％，(P＜0.01)。④在各檢測(cè)點(diǎn)，q-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CMV啟動(dòng)子的AAV9載體在心肌中的分布顯著高于CBA啟動(dòng)子，而在肝臟中則顯著低于CBA啟動(dòng)子(P＜0.01)，迸一步證實(shí)AAV9-CMV-eGFP載體的嗜心肌性、AAV9-CBA-eGFP載體的嗜肝性。⑤生化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AAV9載體轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)心肌酶LDH、CK，肝功能AST、ALT，腎功能Cr及BUN無(wú)不良影響。⑥流式細(xì)胞儀檢測(cè)

12、表明CMV和CBA啟動(dòng)子的AAV9載體均可高效的轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞，且隨著感染劑量的增加而逐漸增強(qiáng)，但是相同感染劑量下相比，兩啟動(dòng)子對(duì)心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率無(wú)明顯差異，對(duì)肝細(xì)胞亦無(wú)顯著差異。⑦與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，高劑量CMV與CBA啟動(dòng)子的AAV9載體轉(zhuǎn)染并未導(dǎo)致的心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞凋亡。
　　第三部分:①CaMEK基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可高效激活老齡小鼠心肌ERK1/2信號(hào)通路，與對(duì)照和空病毒組相比，MEK、p-ERK1/2、p-P70S6K和p-

13、P90RSK的表達(dá)顯著增加。②對(duì)于離體心臟研究，CaMEK基因過(guò)表達(dá)有效保護(hù)老齡缺血心肌?？詹《窘M、CaMEK基因轉(zhuǎn)導(dǎo)組IR與IPost的心肌梗死面積分別為48.0±7.7％ vs44.0±8.0％、31.3±5.3％ vs28.5±6.5％，心肌細(xì)胞凋亡率分別為14.3±2.1％ vs13.6±1.9％、5.0±1.3％vs4.9±1.2％，心梗面積及細(xì)胞凋亡率與空病毒組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明ERK1/2信號(hào)通路激活后有效保護(hù)老

14、齡缺血心肌。③對(duì)于在體心臟研究，CaMEK基因過(guò)表達(dá)同樣可有效降低老齡小鼠心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡率。老齡小鼠心肌缺血1h，再灌注24h后，Control、空病毒及CaMEK三組的心梗面積分別為44.2±7.4％ vs43.4±6.0％vs27.5±4.7％;心肌細(xì)胞凋亡率分別為16.1±1.9％ vs16.4±2.0％ vs5.5±2.3％，與Control和空病毒組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax顯著增加，與

15、空病毒相比P＜0.01。④CaMEK組的心肌酶CK、CK-MB、LDH亦顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　?、貳RK1/2信號(hào)通路是參與并介導(dǎo)缺血后適應(yīng)心肌保護(hù)作用年齡異質(zhì)性的關(guān)鍵靶點(diǎn)。缺血后適應(yīng)在再灌注早期通過(guò)激活ERK1/2信號(hào)通路減輕年輕小鼠心肌缺血再灌注損傷，AKT信號(hào)通路并未參與缺血后適應(yīng)的心肌保護(hù)作用;②缺血后適應(yīng)對(duì)老齡小鼠心肌沒(méi)有保護(hù)作用與ERK1/2信號(hào)通路未有效激活有關(guān)，且老齡小鼠心肌對(duì)缺血再灌注

16、損傷的敏感性顯著增加，再灌注后心肌梗死面積顯著增加。③CMV啟動(dòng)子的重組AAV9載體可在小鼠心肌中長(zhǎng)期穩(wěn)定的高效率表達(dá)，但在肝臟中CMV啟動(dòng)子活性很容易被沉默，AAV9-CMV載體是一種較為理想的心臟疾病基因治療載體;④CBA啟動(dòng)子的重組AAV9載體對(duì)肝臟有極高的親嗜性，可介導(dǎo)外源基因在肝臟中長(zhǎng)期穩(wěn)定的高效表達(dá)，是較為理想的肝臟疾病基因治療載體系統(tǒng)。⑤靶向激活心肌ERK1/2信號(hào)通路激發(fā)心肌內(nèi)源性抗損傷能力是防治老齡心肌缺血再灌注損傷的