減蛋綜合征病毒五鄰體、纖維蛋白和六鄰體的原核表達及抗原性分析.pdf

1、本研究以EDSV京911株為基礎材料，經過鴨胚繁毒、提取DNA，并以此為模板，參考GenBank上發(fā)表的國際標準株AV-127的全基因序列(序列號AC000004)設計了8對特異性引物，PCR擴增出目的基因，并將其克隆到pMD18-T載體上，轉化到宿主菌TG1感受態(tài)細胞中，經質粒PCR、酶切鑒定以及測序證明，最終得到了該株病毒包含52/55k、Ⅲa、五鄰體、pⅦ、pⅩ、pⅥ、六鄰體、EP、100k、pⅧ和纖維蛋白的部分基因，共15715

2、bp。將EDSV京911株與其它腺病毒進行核苷酸和氨基酸序列比對，結果顯示EDSV京911株與AV-127株高度同源，除纖維蛋白和pⅧ外，其它蛋白的同源性都在99.00％以上，其中五鄰體、六鄰體、巰基內肽酶、PⅥ和PⅩ氨基酸序列完全一致，由此推論EDSV京911株與AV-127株可能為同一基因型。同時，根據序列比對結果繪制了五鄰體、六鄰體和巰基內肽酶系統(tǒng)發(fā)生樹，結果顯示EDSV與OAV287和BAdV-4遺傳關系最近。 根據已獲

3、得的京911株核苷酸序列，并參考AV-127株的五鄰體、纖維蛋白和六鄰體全基因序列，分別設計合成了帶有酶切位點的特異性引物，最終克隆得到包括起始密碼子和終止密碼子在內的完整基因序列。將目的基因通過EcoRI和HindⅢ位點插入到表達載體pET-30a(+)，獲得的陽性質粒分別命名為pET-30a-Penton、pET-30a-Fiber和pET-30a-Hexon，將陽性質粒轉化大腸桿菌Rosetta，經IPTG誘導表達，SDS-PAG