減蛋綜合征病毒Hexon蛋白誘導鴨胚成纖維細胞凋亡的研究.pdf

1、減蛋綜合征病毒(Egg drop syndrome virus，EDSV)來源于鴨，被命名為鴨腺病毒Ⅰ型，EDSV主要引起雞的產蛋率及蛋品質的下降。近年來，研究表明EDSV可以導致雛鴨發(fā)生急性呼吸道感染，甚至出現死亡。目前，對人類感染腺病毒進行了廣泛的研究，但是對于禽類感染EDSV的機制研究較少。在本研究中，EDSV及其Hexon蛋白均可以誘導鴨胚胎成纖維細胞(Duck embryonic fibroblast，DEF)發(fā)生細胞凋亡，從

2、而為研究該病毒對禽類的致病機理提供相關的理論基礎及科學依據。本試驗結果如下:
　　1.將EDSV接種DEF單層細胞后檢測細胞病變效應(CPE)及病毒增殖水平。結果表明，EDSV感染DEF細胞均出現明顯的細胞病變，隨著感染時間延長，細胞界限不清楚，貼附性降低，細胞漂浮增多。利用實時熒光定量PCR方法檢測EDSV在DEF細胞中的增殖規(guī)律表明:病毒水平在感染后24 h～60 h持續(xù)增殖。細胞培養(yǎng)上清液中的病毒血凝效價檢測表明，隨著感染時

3、間的增加，病毒血凝效價從感染初期23上升至28。以上說明EDSV可以在DEF細胞上穩(wěn)定持續(xù)的增殖并引起病變效應。
　　2.利用流式細胞術研究EDSV誘導DEF細胞發(fā)生凋亡的結果表明，EDSV感染DEF細胞后24 h時凋亡率開始升高，在感染后60 h時凋亡率達到29.1％，差異顯著(P＜0.05)。TUNEL檢測發(fā)現凋亡陽性細胞數目在感染36 h～60 h時顯著增加。利用Caspase活性實驗以及Western blot法檢測表明，

4、EDSV感染能夠激活Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9，并且上調細胞內Bax的表達，下調細胞內Bcl-2的表達，Bax/Bcl-2的比率隨感染時間延長逐漸上升且差異顯著(P＜0.05)。
　　3.成功構建EDSV Hexon蛋白的真核載體pCDNA-3.1-Hexon，轉染pCDNA-3.1-Hexon的DEF細胞在轉染后24 h、36h時Hexon的表達量較高，隨后有所下降。利用TUNEL染色法發(fā)現，DE

5、F轉染pCDNA-3.1-Hexon后發(fā)生凋亡的陽性細胞的數目較對照組陽性細胞顯著升高(P＜0.05)，并且同組轉染細胞在24 h、36 h時TUNEL陽性細胞數目較48 h、60 h時顯著升高(P＜0.05)。Caspase活性和Western blot檢測結果顯示DEF細胞轉染pCDNA-3.1-Hexon后， Caspase-8、Caspase-9及Caspase-3的活性在24 h、36 h時被激活。同時細胞內Bax的表達升高，