幾丁質(zhì)脫乙酰酶產(chǎn)生菌的篩選.pdf

1、幾丁質(zhì)脫乙酰酶(Chitin deacetylaSe,簡(jiǎn)稱CDA)是能夠?qū)锥≠|(zhì)分子中的乙?；苯用摮蓺ぞ厶堑拿?而幾丁質(zhì)作為酶的底物,難溶于水,因此CDA酶活力的測(cè)定非常復(fù)雜和困難,使得CDA的相關(guān)研究進(jìn)展緩慢。本論文研究探討了以對(duì)硝基乙酰苯胺作為CDA的底物、以對(duì)硝基苯胺作為CDA催化脫乙酰產(chǎn)物測(cè)定CDA活力的可能性,并建立了-種簡(jiǎn)便、高效的酶活力測(cè)定方法。實(shí)驗(yàn)考察了對(duì)硝基乙酰苯胺和對(duì)硝基苯胺的特征吸收峰；通過(guò)考察不同緩沖液體

2、系的紫外可見(jiàn)吸收波譜排除了緩沖液對(duì)酶活力測(cè)定的干擾；模擬酶解體系測(cè)定結(jié)果表明,建立的酶活測(cè)定方法具有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。 以幾丁質(zhì)為唯一碳源,以對(duì)硝基乙酰苯胺為顏色指示劑,采用平板變色圈法,從15份土樣中篩選獲得459株菌,通過(guò)變色濾紙條檢驗(yàn)法從459株菌株中得到使濾紙條變色較快、較深的菌株268株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,測(cè)定發(fā)酵液的CDA酶活力,獲得一株產(chǎn)酶活力較高且性能穩(wěn)定的CDA產(chǎn)生菌11-3。測(cè)得菌株粗酶對(duì)膠體幾丁質(zhì)作用產(chǎn)物證實(shí)

3、有乙酸產(chǎn)生,說(shuō)明該菌株產(chǎn)酶對(duì)膠體幾丁質(zhì)具有脫乙酰作用。通過(guò)BIOLOG細(xì)菌鑒定系統(tǒng)分析和16SrDNA序列分析,結(jié)合菌株11-3的培養(yǎng)特征及生理生化特征,鑒定菌株11-3為紅球菌屬(ghodococcus sp.),迄今為止未見(jiàn)該類菌產(chǎn)生CDA的研究報(bào)道。 研究確定了菌株11-3產(chǎn)酶的較優(yōu)培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件。菌株11-3發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基碳源以白砂糖最佳,氮源以蛋白胨最佳,并需要添加硫酸銨和玉米漿,乙酸鈉、磷酸二氫鉀對(duì)產(chǎn)酶有促進(jìn)作

4、用,而乙酸銨、硫酸亞鐵對(duì)產(chǎn)酶則有抑制作用,硫酸鎂、氯化鈣、硫酸錳對(duì)產(chǎn)酶影響不大。產(chǎn)酶最佳培養(yǎng)基組成(g/L)：蛋白胨2.5,白砂糖7.0,硫酸銨2.5,磷酸二氫鉀1.5,乙酸鈉2.0,玉米漿5.0。最佳培養(yǎng)條件為：250mL三角瓶裝液量30mL～35mL,發(fā)酵初始pH為7.5,種齡24h,接種量5％,培養(yǎng)溫度30℃,搖床轉(zhuǎn)速180r/min,發(fā)酵周期60h。產(chǎn)酶條件優(yōu)化后,菌株11-3產(chǎn)酶水平提高了近100倍,且性能穩(wěn)定,說(shuō)明菌株11-

5、3是一支具有開(kāi)發(fā)潛力的CDA生產(chǎn)菌株。 研究了菌株11-3的部分酶學(xué)性質(zhì)。菌株11-3粗酶具有較好的熱穩(wěn)定性,45℃保溫1h仍能保持90％以上的活力,酶的最適作用溫度為50℃：最適作用pH為7.0,在pH7.0-10.0之間有較高的活性,Ag+對(duì)該酶有較強(qiáng)的抑制作用。 本論文建立了一種簡(jiǎn)便、高效的CDA酶活力測(cè)定方法,并利用該方法篩選獲得一支性能穩(wěn)定、產(chǎn)CDA活力較高、熱穩(wěn)定性好的紅球菌11-3,為進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)研究奠定