甜菜夜蛾幾丁質(zhì)脫乙酰酶1(CDA1)的鑒定與分析.pdf

1、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua Hübner），屬鱗翅目夜蛾科，是一種世界性分布的害蟲(chóng)。其取食范圍非常廣泛，對(duì)多種糧食作物、蔬菜、經(jīng)濟(jì)作物和油料作物等造成嚴(yán)重危害。昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)脫乙酰酶(Chitin deacetylase，CDA)是幾丁質(zhì)的修飾酶之一，可水解幾丁質(zhì)中的乙酰胺基，將幾丁質(zhì)降解成脫乙酰幾丁質(zhì)，是昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)代謝中的一種關(guān)鍵酶，在昆蟲(chóng)的多種生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。
　　本研究以甜菜夜蛾S.exigua5齡幼蟲(chóng)

2、中腸為材料提取總RNA，利用RT-PCR及RACE技術(shù)，擴(kuò)增得到甜菜夜蛾幾丁質(zhì)脫乙酰酶1(chitin deacetylase1)基因的cDNA全長(zhǎng)序列，GenBank登錄號(hào)為KJ621414。該基因全長(zhǎng)1659bp，包括一個(gè)1554bp的開(kāi)放閱讀框，編碼518個(gè)氨基酸，N-端具有23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，預(yù)測(cè)蛋白(SeCDA1)分子量為61.5kDa，等電點(diǎn)為4.83; NCBI BLAST分析結(jié)果表明，SeCDA1含有低密度脂蛋白結(jié)

3、合區(qū)(LDLa)、幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)(ChBD)和脫乙?；复呋瘏^(qū)(CDA)，屬于GroupⅠ類CDA蛋白。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該序列分別含有3個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)和5個(gè)O-聯(lián)糖基化位點(diǎn)。
　　secda1基因能夠在原核細(xì)胞中表達(dá)61.5kDa目的蛋白，免疫家兔獲得SeCDA1蛋白的特異性抗體。secda1基因在畢赤酵母細(xì)胞中表達(dá)80kDa的目的蛋白。構(gòu)建重組桿狀病毒表達(dá)載體pFastBac-secda1，Western blot分析表明

4、secda1基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞BTI-Tn-5B1-4（HighFive）中成功表達(dá)80kDa蛋白。脫乙酰基酶活性測(cè)定結(jié)果顯示昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)的SeCDA1蛋白及畢赤酵母表達(dá)的SeCDA1蛋白均具有脫乙?；富钚裕謩e為1.88U/mL及1.35U/mL。
　　利用SeCDA1特異性抗體對(duì)SeCDA1進(jìn)行免疫組織定位顯示，SeCDA1蛋白在卵、幼蟲(chóng)和蛹期中均有表達(dá)。qPCR結(jié)果顯示secda1基因在卵、幼蟲(chóng)和蛹期中均有表達(dá)，而在卵中表達(dá)量