人肝癌胞VEGFA異構(gòu)基因剪切體異達(dá)義研差性表及其意的初步究.pdf

1、本研究包括三部分：
　　 第一部分：VEGF165和VEGF165b真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定
　　 目的：構(gòu)建人VEGF165和VEGF165b 真核表達(dá)質(zhì)粒，為研究VEGF165和VEGF165b 蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR 獲得VEGF165的cDNA，BamHI和EcoRI 限制性內(nèi)切酶雙酶切后與真核表達(dá)載體pcDNA3.0 連接，氨芐青霉素篩選，酶切鑒定和測(cè)序鑒定。利用構(gòu)

2、建好的VEGF165質(zhì)粒，采取酶切重組的方法構(gòu)建VEGF165b，氨芐青霉素篩選，酶切鑒定和測(cè)序鑒定。
　　 結(jié)果：經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序鑒定顯示，兩個(gè)重組質(zhì)粒插入基因片段正確，無(wú)突變。
　　 結(jié)論：VEGF165和VEGF165b的真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 第二部分：恩度誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 抑制性VEGFA選擇性剪切異構(gòu)體VEGF165b的表達(dá)及意義
　　 目的：探討重組人血管內(nèi)皮抑素(rh

3、-Endostatin，Endostar，恩度)在人肝癌細(xì)胞SMMC-7721中對(duì)VEGF165b表達(dá)的影響，及上調(diào)VEGF165b表達(dá)后，SMMC-7721對(duì)恩度敏感性的變化。
　　 方法：采用RT-PCR法和Western Blot法，檢測(cè)恩度干預(yù)SMMC-7721 以后VEGF165b的表達(dá)變化；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染VEGF165b 真核表達(dá)質(zhì)粒到SMMC-7721，RT-PCR和免疫細(xì)胞熒光共聚焦顯微鏡檢測(cè)VEGF165b，HIF-

4、1α和下游靶基因VEGFA表達(dá)的變化；MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染VEGF165b 真核表達(dá)質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒相比，恩度對(duì)人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　 結(jié)果：恩度誘導(dǎo)SMMC-7721的VEGF165b mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，而VEGF165b可下調(diào)HIF-1α及下游靶基因VEGFA的表達(dá)。轉(zhuǎn)染VEGF165b 后，恩度引起SMMC-7721的生長(zhǎng)抑制率進(jìn)一步增加。
　　 結(jié)論：恩度抗腫瘤新生血管的作用部分是通過(guò)上調(diào)VEGF165b

5、 介導(dǎo)的，VEGF165b能增加SMMC-7721細(xì)胞對(duì)恩度的敏感性，兩者治療腫瘤有協(xié)同作用。
　　 第三部分：力比泰通過(guò)抑制Sp1 誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞VEGFA基因剪切異構(gòu)體差異性表達(dá)
　　 目的：研究力比泰干預(yù)人肝癌細(xì)胞系HepG2 后Sp1和VEGFA基因的表達(dá)狀況。
　　 力比泰與VEGF165b 或恩度聯(lián)合后誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的變化以及力比泰對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響。
　　 方法：R

6、T-PCR，western blot，細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)力比泰或betulinic acid 干預(yù)HepG2細(xì)胞后，Sp1和VEGFA基因表達(dá)的變化，MTT法檢測(cè)聯(lián)合VEGF165b 或恩度后，Alimta誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的變化，及對(duì)裸鼠移植瘤模型的治療作用。
　　 結(jié)果：力比泰誘導(dǎo)HepG2的Sp1和VEGFA基因表達(dá)下調(diào)，并且誘導(dǎo)VEGFA基因的刺激性異構(gòu)體表達(dá)減少和抑制性異構(gòu)體表達(dá)增加。Sp1的特異性抑制