重組Clara細(xì)胞分泌蛋白對(duì)高氧性肺損傷的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、隨著新生兒學(xué)的發(fā)展，早產(chǎn)兒的存活率大幅度提高，但支氣管肺發(fā)育不良(BPD)的發(fā)病率反而逐年增加，嚴(yán)重影響存活兒的生長(zhǎng)發(fā)育和生存質(zhì)量。BPD是新生兒，尤其是早產(chǎn)兒高氧機(jī)械通氣治療最常見(jiàn)的并發(fā)癥，但至今其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，臨床上尚無(wú)理想的藥物可以防治BPD。 目前，以肺發(fā)育受阻為主要病理改變的“新型BPD”倍受關(guān)注。研究表明，BPD發(fā)生過(guò)程中炎癥反應(yīng)持續(xù)存在，而炎癥能抑制出生后肺泡、小呼吸道和小血管的發(fā)育。細(xì)胞凋亡參與肺損傷的發(fā)

2、病過(guò)程，肺泡上皮細(xì)胞的死亡是高氧性肺損傷的一個(gè)重要特征之一。高氧性肺損傷時(shí)由于Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞變性及破壞，肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白(SP)分泌下降，使肺表面活性物質(zhì)不能有效發(fā)揮其生物學(xué)作用，阻礙肺泡發(fā)育成熟。因此，呼吸道重塑的關(guān)鍵時(shí)期發(fā)生肺損傷可導(dǎo)致肺發(fā)育阻滯。 Clara細(xì)胞分泌蛋白(CCSP)是位于遠(yuǎn)端細(xì)支氣管的無(wú)纖毛立方形上皮細(xì)胞-Clara細(xì)胞分泌的蛋白，是分泌型磷脂酶A2(PLA2)的抑制劑，具有抗炎等多種生物活性，參與

3、體內(nèi)一系列生理、病理過(guò)程，如炎癥、組織重建等。CCSP在體內(nèi)通過(guò)PLA<,2>的抑制作用，減少肺表面活性物質(zhì)的降解、肺彈性回縮力的減弱及肺殘氣量的增加。Ramsay等研究報(bào)道，呼吸窘迫綜合癥患兒生后1d、3d、6d的支氣管肺泡灌洗液中CCSP含量越低，將來(lái)越容易發(fā)展成BPD，提示BPD的發(fā)生與CCSP的變化高度相關(guān)。但國(guó)外諸多研究結(jié)果認(rèn)為外源性CCSP可能通過(guò)抗炎機(jī)制，減輕肺損傷，尚未見(jiàn)與凋亡關(guān)系的研究報(bào)道。 因此，為了探討B(tài)P

4、D發(fā)生過(guò)程中肺內(nèi)CCSP與肺泡上皮細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，本研究從組織、分子水平觀察了BPD不同時(shí)程肺組織形態(tài)學(xué)改變及肺內(nèi)CCSP、肺表面活性物質(zhì)蛋白-A(SP-A)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)的表達(dá)變化和細(xì)胞凋亡程度，以探討高氧對(duì)肺發(fā)育和肺損傷的影響及其機(jī)制。此外，應(yīng)用rh-CCSP進(jìn)行體內(nèi)外干預(yù)后，進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察肺發(fā)育和肺內(nèi)SP-A的表達(dá)及肺細(xì)胞凋亡程度，闡明了rh-CCsP對(duì)高氧性肺損傷的保護(hù)作用。本研究不僅對(duì)新生兒呼吸病理生理的理

5、論意義，也為今后臨床應(yīng)用rh-CCSP防治BPD提供有力的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 一、高氧性肺損傷的機(jī)制研究 1.高氧對(duì)新生大鼠死亡率的影響隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，各組死亡率均呈增高趨勢(shì)?？諝饨M增高緩慢，而高氧組暴露7d后開(kāi)始死亡率迅速增高，與空氣組相比，差異有顯著性，P<0.01。 2.高氧暴露后肺損傷情況高氧暴露不同時(shí)期W/D值比較來(lái)看，空氣組和高氧組3d時(shí)，W/D值無(wú)明顯差異，P>0.05；高

6、氧暴露7d、10d時(shí)，高氧組W/D值較空氣組明顯增加，差異有顯著性，P<0.05；但14d時(shí)，差異不明顯，P>0.05。高氧暴露后3d、7d的支氣管肺泡灌洗液(BALF)中丙二醛54(MDA)含量明顯高于空氣對(duì)照組，差異有顯著性意義，p<0.01。 3.高氧暴露后肺形態(tài)學(xué)變化空氣組3d時(shí)，肺組織基本結(jié)構(gòu)單位為終末囊泡，腔大壁厚，分隔己開(kāi)始，有脊突向腔內(nèi)，囊泡壁內(nèi)許多間質(zhì)細(xì)胞，肺泡數(shù)目少；高氧暴露3d時(shí)，肺組織表現(xiàn)基本同空氣組?？?/p>

7、氣組7d、10d時(shí)，脊明顯增多，肺泡數(shù)目也漸增加；高氧組肺泡數(shù)目較空氣組減少?？諝釴14d時(shí)，肺泡數(shù)目增加更顯著，肺組織基本結(jié)構(gòu)單位為肺泡，但肺泡壁較厚，仍有較多間質(zhì)細(xì)胞；而高氧組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡形成明顯滯后，肺泡結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單化和囊泡化。 4.高氧對(duì)新生大鼠肺組織CCSP、SP-A、TNF-a表達(dá)的影響高氧組Clara細(xì)胞百分率明顯少于空氣組，差異有顯著性，P<0.01；高氧組Clara細(xì)胞免疫陽(yáng)性強(qiáng)度與空氣組相比，差異有顯著性

8、，P<0.01。隨著高氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，Clara細(xì)胞陽(yáng)性率和CCSP表達(dá)強(qiáng)度降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。 高氧暴露7d，兩組SP-A表達(dá)強(qiáng)度比較，差異無(wú)顯著性，P>0.05；但高氧暴露14d后結(jié)果與早期相反，高氧組SP-A表達(dá)較對(duì)照組明顯減少，差異有顯著性，P<0.01。 western blot方法觀察肺組織內(nèi)SP-A表達(dá)，并進(jìn)行半定量分析結(jié)果，高氧暴露3d時(shí)SP-A表達(dá)量高于空氣組，差異有顯著性，P<0

9、.05；高氧暴露5d、7d時(shí)兩組之間無(wú)差異，P>0.05。 高氧組TNF-a的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于空氣組，其表達(dá)在高氧3d時(shí)高峰，高氧7d時(shí)有所下降，但仍明顯高于空氣對(duì)照組，差異有顯著性意義，p<0.01。 5.高氧對(duì)新生大鼠肺組織細(xì)胞凋亡的影響高氧暴露7d、14d時(shí)，肺上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于空氣組的測(cè)定值，差異有顯著性，P<0.01；隨著高氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡程度加重，但不同時(shí)程組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.

10、05。 二、rh-CCSP對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響 高氧處理72h后A549細(xì)胞凋亡率較空氣組明顯增多，差異有顯著性意義，P<0.01；高氧+rh-CCSP組細(xì)胞凋亡率較高氧組明顯減少，差異有顯著性意義，P<0.01；隨著高氧處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率增加。 三、rh-CCSP對(duì)高氧性肺損傷的影響研究 1.RAC值和形態(tài)定量分析：rh-CCSP組較高氧組RAC值明顯增高，肺泡面積比明顯減少，差異有顯著性，

11、P<0.01。 2.SP-A表達(dá)：高氧暴露7d時(shí)，各組SP-A表達(dá)水平，差異無(wú)顯著性意義，P>0.05。但高氧暴露14d時(shí)rh-CCSP+高氧組較高氧組表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)，差異有顯著性意義，P<0.05。 3.TUNEL染色結(jié)果：高氧暴露7d時(shí)，rh-CCSP組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于高氧組的測(cè)定值，差異有顯著性意義，P<0.01。 結(jié)論 1.長(zhǎng)時(shí)間暴露于85％高濃度氧可引起新生鼠肺損傷和肺發(fā)育阻滯。主要表現(xiàn)為肺W

12、/D比值增加和肺泡數(shù)目減少、結(jié)構(gòu)紊亂、RAC值減少等肺組織形態(tài)學(xué)的改變及死亡率上升。 2.高氧誘導(dǎo)肺細(xì)胞凋亡是BPD的重要機(jī)制之一，高氧可能通過(guò)增加TNf-a表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 3.Clara細(xì)胞和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞是氧化損傷的主要靶細(xì)胞，因高氧致Clara細(xì)胞損傷，進(jìn)而抑制CCSP分泌，加重肺損傷；隨著高氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞變性、破壞，使SP-A分泌減少，使PS功能喪失，阻礙肺發(fā)育，促進(jìn)BPD發(fā)生。

13、 4.高氧暴露后A549細(xì)胞的凋亡增加，隨著高氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡程度加重，rh-CCSP能夠有效抑制高氧暴露后肺上皮細(xì)胞的凋亡。 5.高氧暴露后肺內(nèi)CCSP表達(dá)下降，阻礙肺泡發(fā)育，外源性補(bǔ)充rh-CCSP可逆轉(zhuǎn)高氧引起的肺泡化障礙，還能增加肺內(nèi)SP-A分泌，有效抑制肺細(xì)胞凋亡，減輕肺損傷，可預(yù)防和治療BPD的發(fā)生。 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)國(guó)內(nèi)尚無(wú)CCSP與高氧、BPD關(guān)系的研究報(bào)道，更沒(méi)有rh-CCSP對(duì)高氧性肺損傷的影