玉米ZmCKX1和ZmCKX5基因RNAi轉(zhuǎn)基因株系的表型分析及CRISPR-Cas9靶向編輯載體的構(gòu)建.pdf

1、細胞分裂素（Cytokinin，CK）是植物生長和發(fā)育過程的主要調(diào)節(jié)因子，是影響植物生理活動最廣的基本必須激素，其作用包括細胞分裂、細胞分化、營養(yǎng)信號、種子和果實發(fā)育、頂端優(yōu)勢、葉片衰老和相應(yīng)環(huán)境脅迫等。植物體內(nèi)細胞分裂素的動態(tài)平衡主要通過異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（Isopentenyl transferases，IPT）的催化合成和細胞分裂素氧化酶（Cytokinin oxidase，CKX）的不可逆降解來實現(xiàn)。玉米細胞分裂素氧化酶的編碼基因C

2、KX是由13個成員組成的多基因家族，而且不同CKX家族成員在植物發(fā)育過程中表現(xiàn)出特定的時空表達模式，調(diào)節(jié)不同組織和不同發(fā)育時期的細胞分裂素水平。其中ZmCKX1和ZmCKX5基因分別在調(diào)控玉米籽大小和籽粒數(shù)目方面扮演著重要角色。
　　本研究首先以實驗室前期獲得的ZmCKX1和ZmCKX5基因的多個RNAi轉(zhuǎn)基因玉米株系為材料，通過對內(nèi)源ZmCKX1和ZmCKX5基因在授粉后籽粒時期的表達量變化以及植株和穗粒表型性狀的分析，驗證了Z

3、mCKX1和ZmCKX5基因在調(diào)控玉米生長發(fā)育及籽粒產(chǎn)量方面的功能。然后通過克隆玉米ZmU3啟動子并改造sgRNA基因的轉(zhuǎn)錄啟動子，構(gòu)建了玉米ZmCKX1和ZmCKX5基因的CRISPR/Cas9靶向編輯載體系統(tǒng)。并在對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米莖尖轉(zhuǎn)化體系進行驗證的基礎(chǔ)上，以玉米自交系鄭58為轉(zhuǎn)化的受體對所構(gòu)建的編輯載體進行了預(yù)轉(zhuǎn)化。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）玉米RNAi沉默ZmCKX1和ZmCKX5基因表達譜的分析
　　分別對

4、玉米ZmCKX1和ZmCKX5基因的各6個沉默表達株系進行了qPCR分析，比較ZmCKX1和ZmCKX5基因的表達特性。結(jié)果表明，與野生型玉米相比，玉米ZmCKX1和ZmCKX5基因沉默轉(zhuǎn)基因株系在授粉后時期的籽粒中呈現(xiàn)出表達量的明顯下調(diào)。
　　（2）RNAi沉默ZmCKX1和ZmCKX5基因?qū)τ衩咨L發(fā)育和產(chǎn)量的影響
　　分別對玉米ZmCKX1和ZmCKX5基因的各6個沉默表達株系進行植株性狀與穗粒性狀的調(diào)查，與野生型WT

5、相比，T3代純合的ZmCKX1和ZmCKX5基因RNAi抑制株系均呈現(xiàn)差異顯著性；在植株性狀方面，株高、穗位高和穗位葉長均呈現(xiàn)明顯增大趨勢；在產(chǎn)量性狀方面，穗長顯著增加，穗粗顯著減小，單穗行粒數(shù)與總粒數(shù)顯著增加，50粒重顯著增加，穗粒總重也呈現(xiàn)顯著增加的趨勢。表明沉默ZmCKX1和ZmCKX5基因的轉(zhuǎn)基因玉米表現(xiàn)出對生長發(fā)育的籽粒產(chǎn)量名顯促進作用。
　?。?）玉米ZmCKX1和ZmCKX5基因的CRISPR/Cas9靶向編輯系統(tǒng)的

6、構(gòu)建
　　本研究通過對玉米ZmU3啟動子的克隆，構(gòu)建了適用于在玉米中表達sgRNA的CRISPR/Cas9系統(tǒng)載體，通過置換Cas9基因的表達載體骨架，構(gòu)建了具有BASTA抗性的CRISPR/Cas9載體，二者構(gòu)成適用于玉米莖尖轉(zhuǎn)化的基因編輯載體系統(tǒng)。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了玉米ZmCKX1和ZmCKX5基因的CRISPR/Cas9靶向編輯載體各5個。
　?。?）玉米莖尖轉(zhuǎn)化技術(shù)的優(yōu)化研究
　　利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米莖尖轉(zhuǎn)化技