CRP、酶修飾低密度脂蛋白和地爾硫卓對(duì)樹突狀細(xì)胞成熟分化功能的綜合影響.pdf

1、冠心病是目前威脅人類健康的重要疾病，其病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS），近年來人們逐漸認(rèn)識(shí)到炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的重要地位。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)不斷發(fā)展，越來越多的證據(jù)顯示炎癥貫穿了動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的整個(gè)過程。 C反應(yīng)蛋白（C reactive protein，CRP）與冠心病有密切關(guān)系，血漿CRP濃度升高可以預(yù)測(cè)未來發(fā)生冠心病的危險(xiǎn)。CRP在創(chuàng)傷、炎癥和感染時(shí)會(huì)迅速上升，是一種急性期蛋

2、白。臨床上，CRP被作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管炎等炎性疾病的診斷及治療一種指標(biāo)，同時(shí)，在自身免疫性疾病中，CRP作為部分識(shí)別分子，激活相應(yīng)的免疫系統(tǒng)。在體外試驗(yàn)中，CRP表現(xiàn)出既有抗炎又有促炎癥作用，可以促進(jìn)炎癥因子IL-10產(chǎn)生，也可以減少IFN γ；CRP通過封閉抗原表位，抑制抗體結(jié)合抗原，后者可能是抗自身免疫的機(jī)制之一，可以抵抗多種炎性因子造成的損害。 在AS發(fā)生中，LDL異常被認(rèn)為起到了關(guān)鍵的作用。正常的LDL不能促進(jìn)炎癥

3、的發(fā)生，只有經(jīng)過修飾的LDL才能刺激AS的形成。在動(dòng)脈內(nèi)膜下的環(huán)境有利于LDL的修飾，包括被氧化、乙?；蚴潜幻感揎椀龋琇DL被處理后成為致粥樣硬化的蛋白。其中，關(guān)于氧化低密度脂蛋白（Oxidized modified LDL，xo-LDL）和酶修飾低密度脂蛋白（enzymatically modified LDL，E-LDL）研究較多。E-LDL在促炎方面的因素可能較為重要。 E-LDL是致粥樣硬化的重要因素。用胰蛋白酶、膽固

4、醇酯酶、神經(jīng)酰胺酶作用于LDL可以得到酶修飾的LDL。蛋白酶降解脂蛋白apoB100，使膽固醇酯酶作用于暴露出來的脂類，釋放出游離脂肪酸，增加了膽固醇的含量，與細(xì)胞外基質(zhì)緊密結(jié)合。E-LDL與巨噬細(xì)胞上的清道夫受體結(jié)合，促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)吞LDL，有效誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，同時(shí)，酶處理后的LDL可以融合成大的LDL顆粒，激活補(bǔ)體，這種作用與氧化型LDL無關(guān)。E-LDL的沉積伴隨大量的MCP-1、IL-6和少量IL-1β或TNF-α等細(xì)

5、胞因子產(chǎn)生。這些因子在粥樣斑塊形成過程中可能起了重要作用。用單克隆抗體結(jié)合各種LDL證實(shí)在動(dòng)脈粥樣早期損傷處存在E-LDL而不是ox-LDL或天然LDL。 CRP與E-LDL在早期損傷部位共存。且E-LDL只有與CRP結(jié)合才能激活補(bǔ)體。其中一個(gè)分子的CRP可以結(jié)合5個(gè)分子的E-LDL。并且可以通過巨噬細(xì)胞上的CRP受體攝取E-LDL，從而促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成。在此過程中。CRP起了重要的中介作用。CRP可以結(jié)合細(xì)胞表面的FC γ R

6、Ⅱa，與巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞表面受體結(jié)合，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞識(shí)別及吞噬、誘導(dǎo)凋亡、殺傷細(xì)胞作用。 在各種炎癥免疫反應(yīng)中，樹突狀細(xì)胞（Dendritic Cells，DC）起到了重要的作用。DC是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的專職性抗原提呈細(xì)胞（Antigen Presentation Cell，APC），是機(jī)體免疫反應(yīng)的始動(dòng)者。研究發(fā)現(xiàn)DC在AS斑塊中聚集增多，這也提示其免疫機(jī)制參與了AS的發(fā)生和發(fā)展。 地爾硫卓作為一種臨床上常

7、用的鈣離子拮抗劑，可以阻斷鈣離子的內(nèi)流。有研究表明，地爾硫卓可以直接誘導(dǎo)免疫抑制，與環(huán)孢霉素A或甲強(qiáng)龍聯(lián)用可以調(diào)節(jié)機(jī)體的同種異體反應(yīng)，在臨床上有廣泛使用。 在AS中DC的功能變化受多種因素影響，如LDL、CRP、各種細(xì)胞因子及鈣內(nèi)流。冠心病的發(fā)生及發(fā)展伴隨有LDL及CRP的升高，二者對(duì)DC的成熟及分化起到了不同的作用：究竟哪一個(gè)的作用為主，有必要進(jìn)行分析。此外，作為在心血管疾病中常用的鈣離子拮抗劑地爾硫卓是否可以對(duì)DC的活化進(jìn)行

8、抑制，對(duì)冠心病的發(fā)展是否可以起到預(yù)防作用也值得我們進(jìn)行研究。 本課題分為三個(gè)部分，首先在體外培養(yǎng)DC，分別用E-LDL、病理濃度的CRP或同時(shí)加入二者作用于未成熟DC，觀察DC不同表面抗原的表達(dá)及其細(xì)胞因子的分泌情況，并觀察DC刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖能力，了解E-LDL、CRP對(duì)DC成熟分化的影響以及二者同時(shí)作用后DC功能的變化。第二、分別用E-LDL和CRP同時(shí)作用于DC，觀察加或不加用地爾硫卓后DC表面抗原的表達(dá)及細(xì)胞因

9、子的分泌情況，并觀察其刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖能力，了解地爾硫卓對(duì)E-LDL和CRP影響DC功能的作用。第三、建立動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型，觀察主動(dòng)脈斑塊中DC的分布情況。比較其在有無地爾硫卓處理時(shí)的不同，來判斷地爾硫卓在體內(nèi)的綜合效果。結(jié)果如下： 1、各組DC的CD1a、CD80、CD86表型的表達(dá)之間有顯著性差異（F值分別為3． 131、7．761和4．585，P值分別為0．037、<0．001和0．008），CRP組的CD8

10、0較PBS組表達(dá)下降，CD1a和CD86雖無顯著性，但也有下降；E-LDL組的CD1a、CD80和CD86較PBS組顯著升高；CRP和E-LDL同時(shí)作用于DC后，與PBS組比較，僅CD86有顯著升高，與CRP組相比，CD1a、CD80、CD86顯著升高，與E-LDL組相比，CD80顯著下降。 各組IL-12和TNF-α表達(dá)有顯著性差異（F值分別為9．610和5．035，P值為0．000和0．005）。CRP組的TNF-α顯著低于

11、PBS組；E-LDL組的IL-12和TNF-α均顯著高于PBS組。CRP和E-LDL同時(shí)作用于DC后，與PBS組比較，TNF-α顯著升高；與CRP組相比，IL-12和TNF-α均顯著升高，與E-LDL組相比，各因子表達(dá)均無顯著性差異。 各組A值間有顯著性差異（F=10．422，P<0．001）。E-LDL組T淋巴細(xì)胞增殖較CRP組和PBS組顯著增強(qiáng)；CRP/E-LDL組較E-LDL組顯著減弱，較CRP組增強(qiáng)。 2、各組C

12、D1a、CD80、CD86之間有顯著性差異（F值分別為11．174、12．808和6．772，P分別為0．000、0．000和0．004），DIL組的CD1a、CD80較PBS組表達(dá)下降，CD86和HLA-DR雖無顯著性，但也有下降；與CRP/E-LDL組相比，CD1a、CD80、CD86顯著下降。 各組IL-12和TNF-α表達(dá)有顯著性差異（F值分別為12．300和19．270，P值均小于0．001），IL-2和IL-6表達(dá)無

13、顯著性差異。DIL組的IL-12和TNF-α顯著低于PBS組；與CRP/E-LDL組比較，IL-12和TNF-α也有顯著下降。 各組之間A值有顯著性差異（F=5．244，P=0．012）。DIL組的T淋巴細(xì)胞增殖顯著低于CRP/E-LDL組。 3、經(jīng)喂食高脂飲食并予VitD及尼古丁處理后，無論是否加用地爾硫卓，大鼠的TG、TC水平均較對(duì)照組有明顯升高。高脂飲食組與地爾硫卓組之間血脂水平無顯著性差異（F值分別為4．210和

14、4．955，P分別為0．032和0．019）。 不同組主動(dòng)脈上OX62表達(dá)的MOD值之間有顯著性差異（F=34．913，P<0．001）。高脂飲食組和地爾硫卓組的OX62表達(dá)水平均較對(duì)照組有明顯升高。與高脂飲食組比較，地爾硫卓組OX62表達(dá)水平明顯下降， 通過以上實(shí)驗(yàn)，可以得出以下結(jié)論： 1、CRP可直接抑制由外周血培養(yǎng)的未成熟DC的活化；E-LDL可以促進(jìn)DC成熟活化；在CRP存在時(shí)，E-LDL刺激DC活化的作

15、用可能被削弱，但此時(shí)DC功能仍較對(duì)照組有所增強(qiáng)，說明E-LDL的刺激作用強(qiáng)于CRP的抑制作用。 2、加用地爾硫卓后，由E-LDL誘導(dǎo)的DC活化受到抑制，地爾硫卓可能通過抑制自身免疫反應(yīng)的途徑起到抗動(dòng)脈粥樣硬化和穩(wěn)定斑塊的目的。 3、地爾硫卓對(duì)模型大鼠的血脂無明顯影響。但免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AS中OX62的表達(dá)下降，說明在AS中DC的分布減少，地爾硫卓可以抑制DC在AS中的聚集。 綜合了解E-LDL和CRP對(duì)DC功能