羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌LrrG-Sip融合蛋白的制備及其免疫保護(hù)作用研究.pdf

1、無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)，又稱(chēng)為 B群鏈球菌(Group B streptococcus，GBS)，革蘭氏陽(yáng)性菌，可導(dǎo)致多種動(dòng)物（水生動(dòng)物、哺乳動(dòng)物）患病及人類(lèi)多種疾病。近年來(lái)，中國(guó)羅非魚(yú)養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)暴發(fā)了嚴(yán)重的無(wú)乳鏈球菌病，沖擊了中國(guó)羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，阻礙了中國(guó)羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。抗生素治療羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病是目前采用的主要方法，但是抗生素的不合理使用會(huì)增加病原的耐藥性。疫苗因具有高

2、效、安全、無(wú)殘留等特點(diǎn)是預(yù)防羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病的潛在有效手段之一，也是目前研究的熱點(diǎn)。
　　無(wú)乳鏈球菌表面免疫原性蛋白LrrG（Leucine-rich repeat protein from GBS）和Sip（Surface Immunogenic Protein）存在于各種血清型菌株中，高度保守，兩者在抗羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病方面均具有良好的免疫保護(hù)作用。有研究表明將兩個(gè)或兩個(gè)以上免疫原性基因融合，表達(dá)出的融合蛋白的免疫原性要優(yōu)于

3、單一蛋白。本研究試圖將羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌的兩個(gè)免疫原性基因LrrG和Sip融合后表達(dá)，獲得LrrG-Sip融合蛋白，探討該融合蛋白能否提供更好的免疫保護(hù)率。本研究首先根據(jù)序列分析，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌的表面蛋白LrrG和Sip基因，然后利用雙酶切技術(shù)將基因LrrG和Sip串聯(lián)，中間添加具有生物學(xué)保護(hù)功能的疏水性多肽接頭(Gly4Ser)3 linker序列，最后插入到原核表達(dá)載體pCold II中，構(gòu)建原核表達(dá)載體pCold I

4、I-LrrG-Sip，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，經(jīng)過(guò)表達(dá)條件優(yōu)化，成功誘導(dǎo)表達(dá)獲得了LrrG-Sip融合蛋白，并將純化的融合蛋白注射免疫尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）。主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)論如下：
　　1．羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌LrrG-Sip融合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)
　　提取無(wú)乳鏈球菌基因組DNA，查找目的基因LrrG、Sip全基因序列，相關(guān)軟件分析目的基因序列，結(jié)合原核表達(dá)質(zhì)粒pColdⅡ

5、酶切位點(diǎn)和基因序列酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。為使融合蛋白的生物活性盡量接近天然蛋白，在Sip上游引物中添加具有生物學(xué)保護(hù)功能的疏水性多肽接頭(Gly4Ser)3 linker序列。鑒于LrrG、Sip基因較大，通過(guò)重疊延伸PCR技術(shù)容易帶來(lái)堿基突變，本研究采用基因拼接技術(shù)中的雙酶切法分兩步逐個(gè)將Sip和LrrG基因插入pCold II載體中，構(gòu)建原核表達(dá)載體pColdII-LrrG-Sip。將成功構(gòu)建的融合基因原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21

6、(DE3)，SDS-PAGE顯示該融合蛋白以可溶和包涵體2種形式存在。通過(guò)控制變量的方法分別研究了IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)融合蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化。結(jié)果顯示在15℃、IPTG0.5mmol·L-1、誘導(dǎo)9h的條件下，目的蛋白呈可溶狀態(tài)的表達(dá)量最高。經(jīng)His Bind親和柱純化、Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示LrrG-Sip融合蛋白大小與預(yù)測(cè)一致（162kDa）。說(shuō)明成功構(gòu)建了融合基因，獲得了LrrG-

7、Sip融合蛋白，為下一步羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌LrrG-Sip融合蛋白的免疫原性研究奠定了基礎(chǔ)。
　　2?羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌LrrG-Sip融合蛋白免疫原性研究
　　為探究無(wú)乳鏈球菌LrrG和表面免疫原性蛋白Sip串聯(lián)表達(dá)的LrrG-Sip重組融合蛋白的免疫原性，本研究將原核表達(dá)的LrrG–Sip重組融合蛋白分別以0.5μg/g(R1組)、1.0μg/g(R2組)和1.5μg/g(R3組)每尾200μL腹腔注射免疫尼羅羅非魚(yú)，同時(shí)

8、分別注射等同體積的1.0μg/g Sip蛋白（S組）、1.0μg/gLrrG蛋白（L組）以及PBS（P組）作為對(duì)照，所有魚(yú)體免疫兩周后進(jìn)行無(wú)乳鏈球菌人工攻毒，攻毒劑量為其半致死濃度LD50（4.0×108cfu/mL）。結(jié)果顯示R1組對(duì)尼羅羅非魚(yú)的相對(duì)免疫保護(hù)率最高，達(dá)89.14％；且免疫后14d和28d，該組魚(yú)體血清抗體OD值分別達(dá)0.63和0.64，均顯著高于單一蛋白組（S和L）和PBS組（P<0.05）；R1組魚(yú)體血清過(guò)氧化物酶（