羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌RovS轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子缺失突變株的構(gòu)建及其功能分析.pdf

1、無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)是唯一擁有B群特異性抗原的鏈球菌，也是一種人畜共患、傳染性極強(qiáng)的的病原菌。近年來(lái)，由無(wú)乳鏈球菌感染羅非魚(yú)引起的鏈球菌病，由于其發(fā)病快，死亡率高，且疾病一旦爆發(fā)很難控制，使其嚴(yán)重危害羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，并給全球羅非魚(yú)的養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。RovS轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子屬于Rgg家族，是無(wú)乳鏈球菌中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子，能夠在轉(zhuǎn)錄上調(diào)控細(xì)菌基因組中多個(gè)基因的表達(dá)，同時(shí)還能夠與細(xì)菌

2、中其他調(diào)控系統(tǒng)協(xié)同作用，調(diào)控細(xì)菌的生長(zhǎng)、繁殖及代謝等生命活動(dòng)。本研究以羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌ZQ0910 RovS轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子為研究對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建rovS基因缺失突變株，比較野生株和突變株的生物學(xué)性狀，研究其致病力及相關(guān)毒力因子的表達(dá)情況，為進(jìn)一步探討羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌的分子致病機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。
　　利用PCR技術(shù)擴(kuò)增rovS基因上下游同源片段rovS-F、rovS-R，以及紅霉素抗性基因Erm，然后利用溫度敏感型自殺載體pSET

3、4s構(gòu)建重組質(zhì)粒pSET4s-rF-Erm-rR，通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入野生株S.agalactiae ZQ0910中，通過(guò)抗生素（Spc+，100μg·mL-1。Erm+，50μg·mL-1）及溫度雙重標(biāo)記篩選rovS基因缺失突變株，并將其命名為ΔrovS。
　　在相同的培養(yǎng)條件下，通過(guò)細(xì)菌的傳代培養(yǎng)，對(duì)野生株S.agalactiae和突變株ΔrovS的遺傳穩(wěn)定進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，突變株ΔrovS能夠穩(wěn)定的生長(zhǎng)。通過(guò)測(cè)定

4、OD600繪制的野生株和突變株的生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，突變株ΔrovS比野生株S.agalactiae的生長(zhǎng)略為緩慢。革蘭氏染色結(jié)果顯示，rovS基因的缺失并未對(duì)細(xì)菌的革蘭氏染色產(chǎn)生影響。通過(guò)觀察血瓊脂平板上野生株和突變株的生長(zhǎng)形態(tài)發(fā)現(xiàn)，突變株ΔrovS菌落周?chē)划a(chǎn)生β-溶血環(huán)，說(shuō)明rovS基因的缺失改變了細(xì)菌的溶血性。半致死量LD50測(cè)定結(jié)果顯示，突變株ΔrovS的LD50(3.16×106 cfu)是野生株LD50(2.0×107cfu)的