A族鏈球菌多介表位疫苗的完善制備及其動物免疫保護(hù)作用的相關(guān)研究.pdf

1、目的:A族鏈球菌(groupA streptococcus，GAS)是一種常見的革蘭氏陽性菌，可以引起多種侵襲性感染和自身免疫性疾病。在大多數(shù)發(fā)展中國家GAS感染導(dǎo)致的風(fēng)濕熱、風(fēng)濕性心臟病、腎小球腎炎等仍然是嚴(yán)重威脅人們生活質(zhì)量的一大問題。而對于GAS感染的治療目前大多為青霉素、大環(huán)內(nèi)酯類藥物或靜脈注射免疫球蛋白，但由于耐藥性或保護(hù)作用短暫等原因致使GAS感染仍舊保持著很高的復(fù)發(fā)率。所以制備成功有效的GAS疫苗成為GAS預(yù)防和治療的研究

2、熱點。
　　本室前期已構(gòu)建了包含7個FbaA表位和M蛋白1、3、6、18血清型的與人無交叉反應(yīng)的部分基因及M蛋白的C端共同基序（J基因）的pET28a/F7M5[1]，但是根據(jù)近期新的流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國大部分地區(qū)GAS流行菌株中M12血清型占了一大部分。故本實驗在本室構(gòu)建好的質(zhì)粒的外源基因序列上插入M12與人無交叉反應(yīng)的基因片段并表達(dá)，該蛋白命名為F7M6，又以其為模板構(gòu)建表達(dá)了只含有6個不同M蛋白血清型的基因片段，該蛋白命名

3、為M6。將F7M6蛋白，M6蛋白和本室保存的M1全長蛋白（簡稱M蛋白）分別免疫小鼠，通過ELISPOT、ELISA等實驗技術(shù)觀察細(xì)胞免疫和體液免疫效果，并攻毒后計算存活率，以確定疫苗保護(hù)效果。
　　方法:
　　1利用生物信息學(xué)方法在美國疾病預(yù)防和控制中心(CDC)數(shù)據(jù)庫獲GAS M12血清型的基因序列，通過與人體組織基因比對選取與人無交叉反應(yīng)的特異性序列，采用搭橋PCR的方法擴(kuò)增并插入F7M5序列中，得到F7M6序列。

4、>　　2在線預(yù)測F7M6序列表位。
　　3在線預(yù)測F7M6蛋白空間結(jié)構(gòu)和親水性分析。
　　4以F7M6序列為模板，PCR擴(kuò)增出含有M蛋白1、3、6、18、12血清型和M蛋白C端共同基序（J基因）的基因序列，得到M6序列。
　　5將兩段基因片段克隆至載體pET28a中，測序正確后將陽性質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳觀察結(jié)果，Western blot鑒定。采用親和層析純化方法對兩種

5、蛋白進(jìn)行純化。
　　6將純化的兩種蛋白，連同本室保存的GAS M蛋白，以相同劑量聯(lián)合佐劑分別免疫小鼠，腹部皮下多點注射，同時設(shè)立PBS對照組。每組12只，20μg/每只;免疫間隔21天，共免疫4次;于每次免疫10天后下頜竇靜脈取血，分離血清，-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　7末次免疫后10天，處死6只小鼠，ELISPOT檢測小鼠脾臟免疫細(xì)胞表達(dá)IL-4和IFN-γ的水平，ELISA檢測各組血清中IgG、IgG1、IgG2a的水平及動

6、態(tài)變化。
　　8用ELISA法檢測臨床獲取的抗鏈“O”陽性和健康兒童血清與F7M6蛋白的特異性結(jié)合能力。
　　9采用全菌ELIAS法，檢測臨床獲取的GAS菌株與F7M6組血清的結(jié)合能力。
　　10用致死量的M1GAS腹腔攻擊各組剩余下的6只小鼠，觀察并計算各組存活率。
　　結(jié)果:
　　1成功構(gòu)建了pET28a/F7M6、pET28a/M6陽性質(zhì)粒，并成功表達(dá)蛋白。Western blot結(jié)果顯示兩種蛋白均可

7、以與F7M5抗體雜交。
　　2 ELISA檢測各組血清，結(jié)果顯示，隨免疫次數(shù)增加，IgG水平逐漸增高，F(xiàn)7M6組效價達(dá)到1∶669309，M6組效價達(dá)到1∶58158，M蛋白組達(dá)到1∶32980，。F7M6組顯著高于M6組和M蛋白組(P＜0.001)，但M6組和M蛋白組間無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3血清IgG1和IgG2a檢測結(jié)果顯示，三組均可誘導(dǎo)較高水平的相應(yīng)抗體，均顯著高于PBS組(P＜0.001)，IgG1各組間沒有顯著差異

8、，IgG2a水平則F7M6組顯著高于M6組(P=0.009)，但F7M6組與M蛋白組、M6與M蛋白組間沒有差異。
　　4 ELISPOT結(jié)果顯示，IL-4，IFN-γ水平:F7M6、M6和M蛋白組均顯著高于PBS組(P＜0.001)，且F7M6組的水平最高，而M蛋白組高于M6組(P＜0.05)。
　　5用F7M6蛋白作為診斷抗原檢測抗鏈“O”陽性的病人血清及健康人血清，結(jié)果顯示，抗鏈“O”陽性的病人血清，陽性檢出率為(95％

9、)，而健康兒童血清的陽性率為(47.3％)，二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.005)。
　　6 ELISA檢測4株臨床株于不同組的血清的結(jié)合能力，結(jié)果顯示F7M6均能與其結(jié)合。
　　7攻毒后，F(xiàn)7M6、M6和M蛋白各組生存率分別為66.7％、33.3％和66.7％，PBS組全部死亡。統(tǒng)計分析顯示各實驗組均高于PBS組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1成功構(gòu)建并表達(dá)F7M6和M6蛋白。
　　2 F7M6、