當(dāng)歸提取物與P-糖蛋白相互作用的初步研究.pdf

1、一、目的:
　　 研究當(dāng)歸提取物及其相關(guān)成分對P.糖蛋白功能及表達(dá)的影響,以及當(dāng)歸提取物對P-糖蛋白底物羅丹明-123在Caco-2細(xì)胞單層模型上雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。
　　 二、方法:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)驗(yàn)證
　　 為研究當(dāng)歸提取物及其相關(guān)成分對P-糖蛋白功能和表達(dá)的作用而采用P-糖蛋白載體細(xì)胞(結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2)和陰性對照細(xì)胞(臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304)。Caco-2細(xì)胞和ECV304細(xì)胞分

2、別采用MEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)；細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)行細(xì)胞膜上P-糖蛋白表達(dá)驗(yàn)證。
　　 2.當(dāng)歸水提物初步分析及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
　　 首先對當(dāng)歸提取物進(jìn)行初步的分析。然后,采用苯基溴化四氮唑藍(lán)法(MTT)分別考察當(dāng)歸提取物及其相關(guān)成分和陽性對照藥物維拉帕米、地塞米松及環(huán)孢霉素對Caco-2細(xì)胞的毒性,選擇細(xì)胞存活率大于90％的藥物濃度作為非細(xì)胞毒性劑量進(jìn)行下一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
　　 3.當(dāng)歸提取物及相關(guān)成

3、分對P-糖蛋白功能影響
　　 采用流式細(xì)胞術(shù)測定胞內(nèi)羅丹明-123的熒光強(qiáng)度,以地塞米松作為誘導(dǎo)陽性對照,維拉帕米作為抑制陽性對照,分別考察當(dāng)歸提取物及其相關(guān)成分對P-糖蛋白的功能有何影響。
　　 4.當(dāng)歸提取物及相關(guān)成分對P-糖蛋白表達(dá)的影響
　　 使用流式細(xì)胞儀分析當(dāng)歸提取物及其相關(guān)成分對Caco-2細(xì)胞上P-糖蛋白表達(dá)的影響,以地塞米松作為陽性誘導(dǎo)對照,不加藥的Caco-2細(xì)胞為陰性對照。
　　 5

4、.當(dāng)歸提取物及相關(guān)成分對羅丹明-123轉(zhuǎn)運(yùn)的影響
　　 建立Caco-2細(xì)胞單層模型,以環(huán)孢素A作為陽性抑制對照,考察當(dāng)歸提取物及其相關(guān)成分對經(jīng)典P-糖蛋白功能探針?biāo)幬?-羅丹明-123跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響。
　　 三結(jié)果:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)驗(yàn)證
　　 Caco-2細(xì)胞和ECV304細(xì)胞在正常條件下生長旺盛；Caco-2細(xì)胞高表達(dá)P-糖蛋白,可用于研究當(dāng)歸提取物及相關(guān)成分對P-糖蛋白功能和表達(dá)

5、的影響；ECV304細(xì)胞低表達(dá)P-糖蛋白,適合作為陰性對照細(xì)胞。
　　 2.當(dāng)歸水提物初步分析及細(xì)胞毒性試驗(yàn)
　　 對當(dāng)歸水提物的初步分析,其中阿魏酸的含量為0.107％,符合《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn),而醇提物藁本內(nèi)酯含量為1.02％,符合外經(jīng)貿(mào)商業(yè)協(xié)會要求,可用于接下來的實(shí)驗(yàn)。
　　 根據(jù)以下其他實(shí)驗(yàn)所需的最長時間為72小時,選擇72小時為MTT的實(shí)驗(yàn)時間,結(jié)果顯示當(dāng)歸水提物、當(dāng)歸醇提物以及阿魏酸濃度等于或者小于100

6、μg/mL時,細(xì)胞存活率大于90％；佛手柑內(nèi)酯的非細(xì)胞毒性劑量范圍較小,為0.01-1μg/mL；其他三種陽性對照藥物維拉帕米、地塞米松和環(huán)孢霉素則在0.1-10μg/mL范圍內(nèi)對細(xì)胞幾乎沒有毒性。因此在探討當(dāng)歸及其相關(guān)成分對P-糖蛋白功能的作用實(shí)驗(yàn)中,確定當(dāng)歸水提物、當(dāng)歸醇提物和阿魏酸的實(shí)驗(yàn)濃度為10、100μg/mL,佛手柑內(nèi)酯的濃度為1、0.5μg/mL,對照品為10μg/mL。
　　 3.當(dāng)歸提取物及相關(guān)成分對P-糖蛋白

7、功能影響
　　 與陰性對照組相比,藥物與細(xì)胞作用1小時后,當(dāng)歸水提物(10、100μg/mL)對P-糖蛋白介導(dǎo)的羅丹明-123外排顯示有一定的增強(qiáng)作用(P<0.05),而佛手柑內(nèi)酯(1,0.5μg/mL)則有一定的抑制作用,且呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性；當(dāng)歸醇提物(10、100μg/mL)和阿魏酸(10、100μg/mL)與陰性對照組相比熒光強(qiáng)度變化不大,其中這兩個藥物濃度在10μg/mL時,與陰性組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)

8、。
　　 4.當(dāng)歸提取物及相關(guān)成分對P-糖蛋白表達(dá)的影響
　　 在蛋白水平上,藥物與細(xì)胞作用72小時后,當(dāng)歸水提物(100μg/mL)組的熒光強(qiáng)度高于陰性對照組37.02％(P<0.05),當(dāng)歸醇提物(100μg/mL)和佛手柑內(nèi)酯(1μg/mL)組則使熒光強(qiáng)度分別下降了27.77％、15.99％(P<0.05),而阿魏酸(100μg/mL)組較陰性對照組變化不大,結(jié)果與功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的協(xié)同作用。
　　 5.

9、當(dāng)歸提取物及相關(guān)成分對羅丹明-123轉(zhuǎn)運(yùn)的影響
　　 羅丹明-123(Rh-123)雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與陰性對照組(不加藥組)相比,當(dāng)歸水提物(100μg/mL)使羅丹明-123從BL-AP側(cè)的滲透系數(shù)(Papp)增加,外排率(ER)增加(P<0.05)；當(dāng)歸醇提物(100μg/mL)、阿魏酸(100μg/mL)和佛手柑內(nèi)酯(1μg/mL)則使BL-AP側(cè)的滲透系數(shù)(Papp)下降,AP-BL側(cè)的滲透系數(shù)(Papp)有所

10、增加,從而外排率(ER)較對照組降低(P<0.05),說明當(dāng)歸對P-糖蛋白有調(diào)節(jié)作用,但是由于當(dāng)歸成分較多且復(fù)雜,當(dāng)歸水、醇提物以及相關(guān)成分對P-糖蛋白的調(diào)節(jié)方向也不是一致的。
　　 四.結(jié)論:
　　 1.當(dāng)歸水提物對P-糖蛋白具有瞬時誘導(dǎo)功能和72小時的表達(dá)上調(diào)作用,且在羅丹明-123雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中,增加羅丹明-123的外排率,其與P-糖蛋白底物合用是否會引起血藥濃度、藥效的改變,需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的確定。
　　 2