當歸提取物與P-糖蛋白相互作用的初步研究.pdf

1、一、目的:
　　 研究當歸提取物及其相關成分對P.糖蛋白功能及表達的影響,以及當歸提取物對P-糖蛋白底物羅丹明-123在Caco-2細胞單層模型上雙向轉運的影響。
　　 二、方法:
　　 1.細胞培養(yǎng)及形態(tài)學驗證
　　 為研究當歸提取物及其相關成分對P-糖蛋白功能和表達的作用而采用P-糖蛋白載體細胞(結腸癌細胞Caco-2)和陰性對照細胞(臍靜脈內皮細胞ECV304)。Caco-2細胞和ECV304細胞分

2、別采用MEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基進行常規(guī)培養(yǎng)；細胞免疫熒光法進行細胞膜上P-糖蛋白表達驗證。
　　 2.當歸水提物初步分析及細胞毒性實驗
　　 首先對當歸提取物進行初步的分析。然后,采用苯基溴化四氮唑藍法(MTT)分別考察當歸提取物及其相關成分和陽性對照藥物維拉帕米、地塞米松及環(huán)孢霉素對Caco-2細胞的毒性,選擇細胞存活率大于90％的藥物濃度作為非細胞毒性劑量進行下一步細胞實驗。
　　 3.當歸提取物及相關成

3、分對P-糖蛋白功能影響
　　 采用流式細胞術測定胞內羅丹明-123的熒光強度,以地塞米松作為誘導陽性對照,維拉帕米作為抑制陽性對照,分別考察當歸提取物及其相關成分對P-糖蛋白的功能有何影響。
　　 4.當歸提取物及相關成分對P-糖蛋白表達的影響
　　 使用流式細胞儀分析當歸提取物及其相關成分對Caco-2細胞上P-糖蛋白表達的影響,以地塞米松作為陽性誘導對照,不加藥的Caco-2細胞為陰性對照。
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4、.當歸提取物及相關成分對羅丹明-123轉運的影響
　　 建立Caco-2細胞單層模型,以環(huán)孢素A作為陽性抑制對照,考察當歸提取物及其相關成分對經典P-糖蛋白功能探針藥物--羅丹明-123跨細胞膜轉運功能的影響。
　　 三結果:
　　 1.細胞培養(yǎng)和形態(tài)學驗證
　　 Caco-2細胞和ECV304細胞在正常條件下生長旺盛；Caco-2細胞高表達P-糖蛋白,可用于研究當歸提取物及相關成分對P-糖蛋白功能和表達

5、的影響；ECV304細胞低表達P-糖蛋白,適合作為陰性對照細胞。
　　 2.當歸水提物初步分析及細胞毒性試驗
　　 對當歸水提物的初步分析,其中阿魏酸的含量為0.107％,符合《中國藥典》標準,而醇提物藁本內酯含量為1.02％,符合外經貿商業(yè)協會要求,可用于接下來的實驗。
　　 根據以下其他實驗所需的最長時間為72小時,選擇72小時為MTT的實驗時間,結果顯示當歸水提物、當歸醇提物以及阿魏酸濃度等于或者小于100

6、μg/mL時,細胞存活率大于90％；佛手柑內酯的非細胞毒性劑量范圍較小,為0.01-1μg/mL；其他三種陽性對照藥物維拉帕米、地塞米松和環(huán)孢霉素則在0.1-10μg/mL范圍內對細胞幾乎沒有毒性。因此在探討當歸及其相關成分對P-糖蛋白功能的作用實驗中,確定當歸水提物、當歸醇提物和阿魏酸的實驗濃度為10、100μg/mL,佛手柑內酯的濃度為1、0.5μg/mL,對照品為10μg/mL。
　　 3.當歸提取物及相關成分對P-糖蛋白

7、功能影響
　　 與陰性對照組相比,藥物與細胞作用1小時后,當歸水提物(10、100μg/mL)對P-糖蛋白介導的羅丹明-123外排顯示有一定的增強作用(P<0.05),而佛手柑內酯(1,0.5μg/mL)則有一定的抑制作用,且呈現一定的劑量相關性；當歸醇提物(10、100μg/mL)和阿魏酸(10、100μg/mL)與陰性對照組相比熒光強度變化不大,其中這兩個藥物濃度在10μg/mL時,與陰性組相比沒有統計學意義(p>0.05)

8、。
　　 4.當歸提取物及相關成分對P-糖蛋白表達的影響
　　 在蛋白水平上,藥物與細胞作用72小時后,當歸水提物(100μg/mL)組的熒光強度高于陰性對照組37.02％(P<0.05),當歸醇提物(100μg/mL)和佛手柑內酯(1μg/mL)組則使熒光強度分別下降了27.77％、15.99％(P<0.05),而阿魏酸(100μg/mL)組較陰性對照組變化不大,結果與功能實驗結果有一定的協同作用。
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9、當歸提取物及相關成分對羅丹明-123轉運的影響
　　 羅丹明-123(Rh-123)雙向跨膜轉運實驗結果顯示,與陰性對照組(不加藥組)相比,當歸水提物(100μg/mL)使羅丹明-123從BL-AP側的滲透系數(Papp)增加,外排率(ER)增加(P<0.05)；當歸醇提物(100μg/mL)、阿魏酸(100μg/mL)和佛手柑內酯(1μg/mL)則使BL-AP側的滲透系數(Papp)下降,AP-BL側的滲透系數(Papp)有所

10、增加,從而外排率(ER)較對照組降低(P<0.05),說明當歸對P-糖蛋白有調節(jié)作用,但是由于當歸成分較多且復雜,當歸水、醇提物以及相關成分對P-糖蛋白的調節(jié)方向也不是一致的。
　　 四.結論:
　　 1.當歸水提物對P-糖蛋白具有瞬時誘導功能和72小時的表達上調作用,且在羅丹明-123雙向跨膜轉運中,增加羅丹明-123的外排率,其與P-糖蛋白底物合用是否會引起血藥濃度、藥效的改變,需要體內實驗的確定。
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