單純皰疹病毒Ⅰ型VP26蛋白在病毒感染過程中的分子生物學(xué)功能分析.pdf

1、單純皰疹病毒Ⅰ（HSV-1）是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雙鏈DNA病毒，具有較強(qiáng)傳染性，在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過程中與宿主細(xì)胞之間表現(xiàn)有多種相互作用。HSV-1與細(xì)胞的相互作用是研究HSV-1感染不同細(xì)胞后會形成不同的感染過程及結(jié)果的基礎(chǔ)。以這個角度來看，對于病毒蛋白及其細(xì)胞作用蛋白在病毒感染周期中的功能分析，在探索細(xì)胞對病毒感染產(chǎn)生相應(yīng)反應(yīng)的機(jī)理，和由此機(jī)理所導(dǎo)致的各種可能的生物學(xué)意義，以及由此確定的臨床治療或診斷方法等領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用都具有很大的意義。

2、r>　　 HSV-1VP26是核衣殼組成中最小的蛋白，其功能至今尚未闡明。本實驗的研究重點(diǎn)是分析在病毒感染周期中病毒核衣殼蛋白VP26的功能及尋找與其相互作用的細(xì)胞蛋白。首先構(gòu)建了UL35-EGFP重組病毒，利用該重組病毒與野毒株的生長曲線的差異分析，發(fā)現(xiàn)重組病毒出現(xiàn)了出胞膜阻滯的現(xiàn)象，提示VP26的功能可能與病毒感染周期中的出質(zhì)膜環(huán)節(jié)相關(guān)。隨后通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩查到VP26和細(xì)胞膜上的蛋白——CMTP-7有相互作用，免疫共沉淀和雙

3、熒光細(xì)胞共定位分析驗證了二者在完整細(xì)胞中存在生理性相互作用。隨后采用siRNA技術(shù)和實時定量PCR方法進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，在敲除CMTP-7蛋白的細(xì)胞內(nèi)，病毒復(fù)制裝配未受影響，但出現(xiàn)病毒出胞阻滯的現(xiàn)象，檢測病毒滴度發(fā)現(xiàn)病毒生長量低于正常細(xì)胞內(nèi)的所得數(shù)量，運(yùn)用透射電鏡也觀察到了在近細(xì)胞膜的胞質(zhì)外圍處出現(xiàn)了堆積成團(tuán)的病毒。而流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)在病毒出細(xì)胞時CMTP-7也隨之減少。這些結(jié)果表明CMTP-7的功能和HSV-1出質(zhì)膜這一過程相關(guān)。

4、HSV-1在CMTP-7蛋白敲除的細(xì)胞內(nèi)和UL35-EGFP重組病毒在正常細(xì)胞內(nèi)所表現(xiàn)出的特性極為相似。
　　 以上結(jié)果強(qiáng)烈提示二者通過相互作用在完成同一項功能。即VP26具有與病毒包膜化和有效出胞膜的相關(guān)功能，并且是通過CMTP-7相互作用來完成這一對病毒感染周期至關(guān)重要的過程。而在熒光顯微鏡下還觀察到，CMTP-7可以隨病毒再次感染其它細(xì)胞。并且在新生病毒粒上檢測出了CMTP-7蛋白。這些結(jié)果似乎表明CMTP-7和VP26作