大鼠基底前腦nestin-ir神經(jīng)元的化學(xué)屬性、生后發(fā)育和神經(jīng)毒性耐受研究.pdf

1、基底前腦是指端腦和間腦腹側(cè)和內(nèi)側(cè)的一些灰質(zhì)結(jié)構(gòu)，其中內(nèi)側(cè)隔核(medial septum，MS)、Broca斜角帶的垂直支(vertical diagonal band of Broca，vDB)和水平支(horizontal diagonal band of Broca，hDB)組成隔-斜角帶(MS-DBB)復(fù)合體是其中的重要組成部分。基底前腦作為一個高度異質(zhì)性腦區(qū)，與不同的腦區(qū)發(fā)生廣泛聯(lián)系，與學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知、覺醒、注意力、行為狀態(tài)控

2、制、情感、可塑性等方面密切相關(guān)，同時被認(rèn)為與多種退行性疾病如AD的病理發(fā)生過程存在緊密聯(lián)系。最近本實驗室的研究發(fā)現(xiàn)在成年大鼠和成年人的基底前腦存在著一群nestin免疫陽性(nestin-ir)神經(jīng)元，并認(rèn)為這群神經(jīng)元是區(qū)別于膽堿能神經(jīng)元和γ-氨基丁酸(GABA)能神經(jīng)元的成熟神經(jīng)元。這群神經(jīng)元的形態(tài)和分布與膽堿能神經(jīng)元相似，發(fā)出纖維投射到海馬、大腦皮質(zhì)和丘腦，并與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)。但前期的共存表達(dá)研究其神經(jīng)化學(xué)屬性在實驗方法上具有

3、一定的缺陷，有必要進(jìn)一步明確其化學(xué)屬性，同時這群nestin-ir神經(jīng)元的生后發(fā)育和對神經(jīng)毒性藥物的耐受研究都尚不清楚。
　　 目的：
　　 本研究的目的在于明確基底前腦nestin-ir神經(jīng)元的神經(jīng)化學(xué)屬性；探討基底前腦nestin-ir神經(jīng)元生后發(fā)育規(guī)律；觀察神經(jīng)免疫毒性藥物192IgG-saporin對nestin-ir神經(jīng)元影響的時效關(guān)系，以進(jìn)一步了解成年大鼠nestin表達(dá)在成熟神經(jīng)元的功能和特性。本研究結(jié)果將

4、進(jìn)一步為今后探討nestin-ir神經(jīng)元的功能和特性提供資料和線索。
　　 材料和方法：
　　 本課題主要分為3個部分：1、運用nestin/ChAT,nestin/NGFR，ChAT/PV免疫熒光雙標(biāo)染色觀察成年大鼠基底前腦nestin-ir神經(jīng)元的神經(jīng)化學(xué)屬性。2、運用nestin,ChAT,PV免疫組化染色觀察nestin-ir神經(jīng)元、膽堿能和GABA能神經(jīng)元的生后發(fā)育情況。3、運用nestin/ChAT免疫組化技

5、術(shù)結(jié)合免疫熒光雙標(biāo)染色觀察神經(jīng)免疫毒性藥物192IgG-saporin對nestin-ir神經(jīng)元影響的時效關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1.成年大鼠基底前腦nestin-ir神經(jīng)元主要集中分布在基底前腦隔—斜角帶復(fù)合體的嘴側(cè)和中間部，其尾側(cè)部分布較少。nestin-ir神經(jīng)元在隔—斜角帶復(fù)合體的各個水平都間雜分布在ChAT-ir或NGFR-ir神經(jīng)元之間。另外PV-ir神經(jīng)元空間分布與nestin-ir有明顯不同，在同一水

6、平斷面觀察發(fā)現(xiàn)在內(nèi)側(cè)隔核PV-ir神經(jīng)元多分布在中內(nèi)側(cè)部靠近中線排列，外側(cè)部分布極少；而在斜角帶PV-ir神經(jīng)元多分布在nestin-ir神經(jīng)元的背側(cè)。免疫熒光雙標(biāo)研究發(fā)現(xiàn)nestin-ir神經(jīng)元全部表達(dá)ChAT，但不表達(dá)PV。進(jìn)一步的研究表明其中43％的膽堿能神經(jīng)元表達(dá)nestin，并且約95％的nestin-ir神經(jīng)元呈NGFR陽性反應(yīng)。另外我們也發(fā)現(xiàn)在Meynert基底核(NBM)也存在少量nestin-ir神經(jīng)元分布，同樣全部共

7、存表達(dá)ChAT。
　　 2.基底前腦nestin免疫陽性神經(jīng)元生后發(fā)育最早出現(xiàn)在P9，晚于膽堿能神經(jīng)元的P1，但早于PV免疫陽性神經(jīng)元的P16。在P9時nestin-ir神經(jīng)元形態(tài)不成熟，胞漿淡染，胞核不著色，幾乎沒有突起。在P16天時，神經(jīng)元形態(tài)已明顯成熟，胞漿深染，根據(jù)胞體大小、分布和樹突分支常分為兩組。一組位于MS，胞體多呈圓形、卵圓形或多極形，常由胞體發(fā)出1～2支較粗的初級樹突，其直徑逐漸減小。也有少部分神經(jīng)元不發(fā)出突起

8、。另一組位于vDB和hDB，其胞體明顯較第一組稍大，大多呈卵圓形、雙極或多極形，常有1～3支突起。其發(fā)育成熟的高峰期主要在P9-P16，在P28時生后發(fā)育達(dá)到成年模式。在發(fā)育過程中nestin-ir始終共存表達(dá)ChAT，同時我們還發(fā)現(xiàn)在紋狀體的尾殼核出現(xiàn)成熟神經(jīng)元一過性表達(dá)nestin。
　　 3.在192IgG-Saporin注射后，nestin-ir和ChAT-ir神經(jīng)元形態(tài)觀察其胞體、突起形態(tài)與正常對照組比較均未見明顯改變

9、。192IgG-Saporin注射后3d、7d的nestin陽性神經(jīng)元數(shù)量在MS下降分別約為22％和30％(P＜0.05)，在DBB下降分別約為20％和34％(P＜0.05)。最后在14d時nestin陽性神經(jīng)元數(shù)量減少到最低，MS、DBB分別減少了53％和55％(P＜0.05)，其數(shù)量變化趨勢呈現(xiàn)明顯的時間效應(yīng)關(guān)系。但隨后nestin陽性神經(jīng)元開始逐漸恢復(fù)，在28d時nestin陽性神經(jīng)元基本恢復(fù)到正常水平，與正常對照組比較無差異(P

10、＞0.05)。而ChAT-ir神經(jīng)元在3d、7d時在MS下降分別約為26％和43％(P＜0.05)，在DBB下降分別約為23％和37％(P＜0.05)。最后在14d時ChAT陽性神經(jīng)元數(shù)量減少到最低，在MS、DBB分別減少了72％、58％(P＜0.05)。盡管隨后ChAT陽性神經(jīng)元有緩慢部分恢復(fù)，但在28d時ChAT陽性神經(jīng)元相比正常對照組在MS、DBB仍減少約50％和38％(P＜0.05)。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示各時間點的nestin-

11、ir神經(jīng)元都呈ChAT陽性反應(yīng)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)無論在MS還是DBB，無論是192IgG-Saporin注射后的早期還是晚期nestin-膽堿能神經(jīng)元下降幅度相比nestin+膽堿能神經(jīng)元更明顯，而且在28d時它并不像nestin+膽堿能神經(jīng)元能恢復(fù)到正常水平。
　　 結(jié)論：
　　 1、成年大鼠基底前腦的確存在一群成熟的nestin免疫陽性神經(jīng)元，其主要集中分布在隔-斜角帶復(fù)合體的嘴側(cè)和中間部。首次通過免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)證實

12、nestin-ir神經(jīng)元的神經(jīng)化學(xué)屬性：即nestin-ir神經(jīng)元是膽堿能神經(jīng)元的亞類，約占膽堿能神經(jīng)元43％左右，并且nestin-ir神經(jīng)元絕大多數(shù)是NGFR陽性。另外在Meynert基底核(NBM)也存在少量nestin-ir神經(jīng)元分布，同樣共存表達(dá)ChAT。
　　 2、基底前腦nestin免疫陽性神經(jīng)元生后發(fā)育最早出現(xiàn)在P9，晚于膽堿能神經(jīng)元的P1，但早于PV免疫陽性神經(jīng)元的P16。其發(fā)育成熟的高峰期主要在P9-P16，

13、在P28時生后發(fā)育達(dá)到成年模式。同時我們還發(fā)現(xiàn)在紋狀體尾殼核的成熟神經(jīng)元一過性表達(dá)nestin。
　　 3、神經(jīng)免疫毒性藥物192IgG-Saporin對基底前腦nestin陽性和nestin陰性膽堿能神經(jīng)元的影響趨勢不同，兩者在14d以前，其數(shù)量下降趨勢都呈明顯的時間效應(yīng)關(guān)系，但nestin+膽堿能神經(jīng)元相比nestin-膽堿能神經(jīng)元下降幅度更小。同時在28d時nestin陽性膽堿能神經(jīng)元能恢復(fù)到正常水平，而nestin陰性膽