2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、哺乳動(dòng)物不育系20樣激酶1(mammalian sterile20-like kinase1,Mst1),又稱絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶4(serine/threonine-protein kinase4,STK4)和應(yīng)激應(yīng)答激酶2(kinase responsive to stress2,KR S2),是果蠅Hippo基因在哺乳類中的同源基因,編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶,主要參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡以及器官大小等的調(diào)控,具有抑癌作用。

2、  目的:
  從分子、細(xì)胞及動(dòng)物水平探討Mst1基因的抑癌作用及其部分的分子機(jī)理,模擬腫瘤的基因治療,旨在為腫瘤的基因治療進(jìn)行一些有益的嘗試并提供有參考意義的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
  方法:
  1、人野生型Mst1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
  將Mst1 cDNA連接至真核表達(dá)載體pEGFP-N1中,用卡那霉素抗性篩選,菌落PCR及測(cè)序并序列比對(duì)對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。
  2、高表達(dá)Mst1基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞He

3、pG2作用的體外實(shí)驗(yàn)研究
  用PolyJetTM體外DNA轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)pEGFP-N1-Mst1轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2,應(yīng)用MTT比色法、流式細(xì)胞術(shù)及Hoechst33342染色法觀察高表達(dá)Mst1對(duì)細(xì)胞增殖與凋亡的影響;RT-qPCR檢測(cè)Mst1、CTGF、AREG和Survivin mRNA的轉(zhuǎn)錄水平,Western blot方法檢測(cè)MST1、YAP、Phospho-YAP(Ser127)和Caspase-3蛋白的表達(dá)情況

4、,初步探討Mst1基因在體外抑制細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)的分子機(jī)制。另外,我們將MTT比色法、流式細(xì)胞術(shù)與Western blot方法相結(jié)合,初步探討MST1蛋白的表達(dá)和活化與DDP誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)系。
  3、高表達(dá)Mst1基因?qū)θ朔切〖?xì)胞肺癌生長(zhǎng)影響的實(shí)驗(yàn)研究
  用pEGFP-N1-Mst1轉(zhuǎn)染人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549,初步分析細(xì)胞凋亡情況及MST1、YAP、Phospho-YAP(Ser127)蛋白和Mst1、CTGF、

5、AREG和SurvivinmRNA的表達(dá)水平。用Mst1基因?qū)549細(xì)胞形成的裸鼠移植瘤進(jìn)行模擬基因治療,觀察移植瘤的生長(zhǎng)情況,并用免疫組織化學(xué)分析移植瘤中YAP及Phospho-YAP(Ser127)蛋白的表達(dá),初步探討Mst1基因抑制腫瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制。
  結(jié)果:
  1、經(jīng)菌落PCR、序列測(cè)定及比對(duì)結(jié)果顯示成功構(gòu)建了人野生型Mst1基因真核表達(dá)載體pEGFP-N1-Mst1。
  2、用PolyJetTM體外

6、DNA轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)pEGFP-N1-Mst1轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2,細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率及細(xì)胞凋亡率明顯升高,且抑制率隨處理時(shí)間的增加而升高,并且上調(diào)MST1的活性片段MST1(amino terminal truncated form,NT)、Caspase-3的活性片段Caspase-3(cleavage,CL)和YAP的磷酸化形式Phospho-YAP(Ser127)水平,顯著下調(diào)CTGF、AREG和Survivin mRNA表達(dá)水平

7、,DDP的干預(yù)具有促進(jìn)MST1功能的效果。經(jīng)DDP干預(yù), HepG2-MST1細(xì)胞的增殖活性顯著低于HepG2-Vect細(xì)胞(P<0.05),細(xì)胞凋亡率顯著高于HepG2-Vect細(xì)胞(P<0.05),HepG2細(xì)胞中MST1(NT)和Phospho-YAP(Ser127)的水平都隨DDP干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高,但MST1和YAP蛋白總量并沒(méi)有改變。
  3、轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Mst1的A549細(xì)胞凋亡率升高,細(xì)胞中MST1

8、(NT)和Phospho-YAP(Ser127)水平升高,CTGF、AREG和Survivin mRNA表達(dá)水平下降。應(yīng)用Mst1基因、DDP和Mst1基因聯(lián)合DDP的3個(gè)治療組在27天后的平均瘤塊體積和重量均顯著低于Control和陰性對(duì)照組(P<0.01),平均抑瘤率分別為(32.30±1.87)%、(51.77±3.98)%和(73.01±1.22)%,并伴隨著YAP蛋白的胞核陽(yáng)性的降低,YAP和Phospho-YAP(Ser12

9、7)蛋白的胞漿陽(yáng)性的升高。
  結(jié)論:
  1、高表達(dá)Mst1基因促進(jìn)HepG2細(xì)胞和A549細(xì)胞凋亡;
  2、高表達(dá)Mst1基因上調(diào)腫瘤細(xì)胞中MST1(NT)、Caspase-3(CL)和Phospho-YAP(Ser127)蛋白的表達(dá)水平,下調(diào)CTGF、AREG和Survivin mRNA的轉(zhuǎn)錄水平,這可能是高表達(dá)Mst1基因抑制腫瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制之一;
  3、高表達(dá)Mst1能夠增強(qiáng)HepG2細(xì)胞對(duì)DDP

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