半胱胺、胱氨酸和卵丘細(xì)胞在提高山羊裸卵GSH水平及發(fā)育能力中的作用.pdf

1、體外成熟(IVM)之前脫去卵丘細(xì)胞會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷卵母細(xì)胞的胚胎發(fā)育能力和谷胱甘肽(GSH)合成的能力。裸卵(DOs)體外成熟質(zhì)量的低下嚴(yán)重限制了諸如生發(fā)泡(GV)移植，體細(xì)胞單倍體化以及GV期卵母細(xì)胞冷凍保存等胚胎工程技術(shù)的發(fā)展。目前研究人員所應(yīng)用的多種DOs體外成熟系統(tǒng)都只能部分改善其發(fā)育潛能。此外，我們目前對(duì)卵丘細(xì)胞促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量的機(jī)制還知之甚少。因此，建立一種完善的DOs體外成熟系統(tǒng)具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值和理論意義。在本實(shí)驗(yàn)中，

2、我們以山羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物，比較了不同形式的卵丘細(xì)胞(分散的卵丘細(xì)胞、卵丘細(xì)胞單層以及卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體)共培養(yǎng)對(duì)山羊DOs胚胎發(fā)育能力的影響，卵丘細(xì)胞單層培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液中添加激素成分(FSH、LH、17β-E2)對(duì)卵丘細(xì)胞黃體化的抑制作用，此外還詳細(xì)研究了半胱胺、胱氨酸以及卵丘細(xì)胞之間相互作用對(duì)山羊裸卵體外成熟后胞質(zhì)中GSH水平以及發(fā)育能力的影響，以期建立一種高效完善的DOs體外成熟系統(tǒng)并對(duì)卵丘細(xì)胞促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟機(jī)制進(jìn)行深入探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)

3、果表明： 1、山羊DOs的體外成熟率和孤雌激活后的胚胎發(fā)育能力都顯著低于卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)(p＜0.05)，各種形式的卵丘細(xì)胞均能顯著提高裸卵的體外成熟率以及胚胎發(fā)育到桑椹胚的能力(p＜0.05)，但對(duì)其囊胚發(fā)育率并沒有明顯的改善(p＞0.05)。與分散的卵丘細(xì)胞(DCCs)和COCs相比，卵丘細(xì)胞單層對(duì)于裸卵桑椹胚率的提高更明顯。 2、卵丘細(xì)胞單層培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)培養(yǎng)液中含有激素成分(FSH、LH、17β-E

4、2)時(shí)，培養(yǎng)5天后其中的孕酮的含量與無(wú)細(xì)胞的對(duì)照組培養(yǎng)液差異不顯著(p＞0.05)，當(dāng)不添加激素時(shí)卵丘細(xì)胞向培養(yǎng)液中釋放的孕酮量大大增加(p＜0.05)。說(shuō)明培養(yǎng)過(guò)程中激素的存在能夠顯著抑制卵丘細(xì)胞的黃體化。 3、成熟培養(yǎng)液中添加半胱胺能夠濃度依賴性的提高COCs胞質(zhì)中的GSH水平。當(dāng)半胱胺濃度為100μM時(shí)，孤雌激活后囊胚發(fā)育率最高，隨著半胱胺濃度進(jìn)一步升高，囊胚率反而下降，囊胚細(xì)胞數(shù)的變化趨勢(shì)也與之類似。 4、成熟培

5、養(yǎng)液中添加胱氨酸能夠濃度依賴性的提高COCs胞質(zhì)中的GSH水平，當(dāng)胱氨酸濃度為200μM時(shí)，孤雌激活后囊胚發(fā)育率最高，隨著胱氨酸濃度進(jìn)一步升高，囊胚率反而下降，囊胚細(xì)胞數(shù)的變化趨勢(shì)也與之類似。 5、向培養(yǎng)液中同時(shí)添加半胱胺(100μM)和胱氨酸(200μM)能夠使山羊COCs的囊胚發(fā)育率明顯提高(p＜0.05)，但是對(duì)成熟后胞質(zhì)中的GSH水平并沒有進(jìn)一步的影響(p＞0.05)。增加半胱胺和胱氨酸的含量(200μMand500μM

6、respectively)并沒有繼續(xù)提高山羊COCs的囊胚發(fā)育能力和胞質(zhì)中GSH水平。 6、山羊裸卵的體外成熟、胞質(zhì)中GSH合成能力以及胚胎發(fā)育能力都顯著低于COCs(p＜0.05)，向成熟培養(yǎng)液TCM-199中添加半胱胺能夠顯著提高山羊DOs的以上指標(biāo)，但是添加胱氨酸對(duì)DOs的體外成熟，胚胎發(fā)育和GSH合成情況都沒有任何改善。與單獨(dú)添加半胱胺相比，同時(shí)添加時(shí)半胱胺和胱氨酸則能夠明顯改善山羊DOs的體外成熟，囊胚發(fā)育以及GSH合

7、成能力(p＜0.05)。說(shuō)明山羊裸卵本身能夠利用培養(yǎng)液中的半胱胺，但不能利用培養(yǎng)液中的胱氨酸，半胱胺能夠促進(jìn)山羊裸卵對(duì)胱氨酸的利用。 7、在卵丘細(xì)胞單層存在的情況下，向成熟培養(yǎng)液中單獨(dú)添加半胱胺或者胱氨酸都能明顯改善山羊DOs的囊胚發(fā)育以及GSH合成能力，當(dāng)二者同時(shí)存在時(shí)囊胚發(fā)育情況得到進(jìn)一步提高(p＜0.05)，囊胚細(xì)胞數(shù)也較單獨(dú)添加巰基物質(zhì)時(shí)明顯增多(p＜0.05)，達(dá)到與不添加任何巰基物質(zhì)時(shí)COCs類似的水平，但胞質(zhì)GSH