MSCs瘤化發(fā)生過程中STAT3過度激活規(guī)避研究.pdf

1、目的：
　　探討腫瘤微環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)瘤樣轉(zhuǎn)化與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3(Signal Transducer andActivator of Transcription3，STAT3)過表達(dá)的相互關(guān)系;利用STAT3特異性抑制劑STA-21處理來明確抑制STAT3過表達(dá)是否可降低腫瘤微環(huán)境下MSCs瘤樣轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn);進(jìn)而為規(guī)避腫瘤微環(huán)境下MSCs的惡性轉(zhuǎn)化提供科學(xué)依據(jù)，使

2、其更加安全地應(yīng)用于臨床。
　　材料與方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):人乳腺癌細(xì)胞MCF-7B及大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞用DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng);無菌條件下原代分離出大鼠股骨，用不完全培養(yǎng)基沖洗骨髓腔后，轉(zhuǎn)為DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞沉淀。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組:本實(shí)驗(yàn)分兩部分。第一部分實(shí)驗(yàn)分5組?？瞻捉M:單獨(dú)培養(yǎng)的MCF-7B;對照組:加含0.1％ DMSO于培養(yǎng)基中的MCF-7B;實(shí)驗(yàn)組:同空白組外，根據(jù)向培養(yǎng)基內(nèi)加

3、入STA-21濃度不同分為三個不同濃度亞組:第二部分實(shí)驗(yàn)仍設(shè)為5組。空白組:單獨(dú)培養(yǎng)的MSCs;對照組:將MSCs培養(yǎng)在含0.1％ DMSO的6孔板內(nèi)，結(jié)合插入式培養(yǎng)皿與C6構(gòu)建間接共培養(yǎng)體系;實(shí)驗(yàn)組:同對照組外，根據(jù)向6孔板加入STA-21濃度不同分為三個不同濃度亞組。
　　3.實(shí)驗(yàn)方法:
　　1)利用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。
　　2) MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。
　　3)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及凋亡。

4、
　　4)實(shí)時熒光定量PCR檢測MSCs腫瘤相關(guān)基因MDM2、STAT3、CyclinD1、Bcl-xl mRNA的相對表達(dá)量。
　　5) Western blot檢測各組MCF-7B P-STAT3、STAT3、CyclinD1及Bcl-xl蛋白的表達(dá)，檢測各組MSCs共培養(yǎng)7d后MDM2、STAT3，P-STAT3、CyclinD1及Bcl-xl蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1)細(xì)胞形態(tài)
　　隨著STA

5、-21藥物濃度的增加，MCF-7B細(xì)胞出現(xiàn)增殖受抑及調(diào)亡增加，細(xì)胞形態(tài)皺縮，鏡下可見大量死亡的MCF-7B細(xì)胞;
　　MSCs與C6間接共培養(yǎng)7d后，對照組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，胞核變小，胞質(zhì)向胞核中央縮小，細(xì)胞變?yōu)殚L梭形。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞隨著STA-21藥物濃度的增加，MSCs形態(tài)更趨一致，細(xì)胞形態(tài)同空白組近似。
　　2) MTT法檢測細(xì)胞增殖效應(yīng)
　　MTT結(jié)果顯示MCF-7B細(xì)胞經(jīng)不同濃度STA-21作用24h后，細(xì)胞

6、增殖抑制率與空白組比較及組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);對照組MCF-7B細(xì)胞增殖抑制率與空白組接近(P＞0.05);
　　第二部分實(shí)驗(yàn)中對照組MSCs增殖率明顯高于空白組(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組MSCs經(jīng)各濃度STA-21(10、20、30μM)作用7d后，能夠顯著抑制MSCs過度增殖，且隨著STA-21作用濃度的增加，其抑制MSCs增殖的效應(yīng)也不斷增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。
　　3)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

7、>　　流式細(xì)胞結(jié)果顯示空白組MCF-7B細(xì)胞的凋亡率與對照組MCF-7B的凋亡率接近，二者無顯著差異(P＞0.05);實(shí)驗(yàn)組MCF-7B經(jīng)各濃度STA-21作用24h后，細(xì)胞凋亡率明顯增加，與空白組比較及組間比較具有顯著差異(P＜0.01)，提示STA-21可促進(jìn)MCF-7B細(xì)胞凋亡并呈濃度依賴性。
　　4)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期
　　細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，隨著STA-21作用濃度的增加，MCF-7B細(xì)胞G1期比例逐漸增高，

8、較空白組明顯增高(P＜0.05)。表明STA-21可引起MCF-7B細(xì)胞周期阻滯于G1期，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力下降。
　　5)實(shí)時熒光定量PCR檢測5組MSCs腫瘤相關(guān)基因MDM2、STAT3、CyclinD1、Bcl-xl mRNA的相對表達(dá)量
　　結(jié)果顯示，與空白組MSCs相比，對照組高表達(dá)MDM2、STAT3、CyclinD1、Bcl-xl mRNA(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組STA-2110組MDM2、CyclinD1、

9、Bcl-xl mRNA表達(dá)量較空白組增高(P＜0.05);其余各實(shí)驗(yàn)組MDM2、 CyclinD1、Bcl-xl mRNA表達(dá)量接近空白組(P＞0.05);STAT3 mRNA表達(dá)量3個實(shí)驗(yàn)組與空白組接近(P＞0.05)。
　　6) Western blot檢測結(jié)果
　　MCF-7B細(xì)胞經(jīng)不同濃度STA-21處理24h后，與空白組相比STA-21可明顯抑制MCF-7B細(xì)胞P-STAT3蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，并下調(diào)Cyc

10、linD1、Bcl-xl蛋白表達(dá)，差異顯著(P＜0.05)，且隨著STA-21濃度增加上述蛋白表達(dá)量減少;對照組細(xì)胞P-STAT3、CyclinD1、Bcl-xl蛋白表達(dá)量與空白組接近(P＞0.05);5組細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)量近似(P＞0.05)。
　　第二部分:空白組MSCs表達(dá)STAT3，低表達(dá)MDM2、CyclinD1、Bcl-xl，不表達(dá)P-STAT3;對照組MSCs高表達(dá)MDM2、 P-STAT3、CyclinD1及

11、Bcl-xl蛋白，各蛋白表達(dá)量顯著高于空白組(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組MSCs經(jīng)10、20、30μM STA-21處理后，與對照組相比，可明顯降低MDM2、CyclinD1、Bcl-xl蛋白表達(dá)，且隨著STA-21濃度增加上述蛋白表達(dá)量減少，其中均以20μm STA-21處理后變化顯著，除10μm STA-21組少量表達(dá)P-STAT3外，其余實(shí)驗(yàn)組不表達(dá)P-STAT3，類似于空白組(P＞0.05);5組細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)量接近(P＞0