CYP3A29基因在豬支原體肺炎發(fā)生過程中的作用研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、細胞色素P450酶(CYP)是一種能夠氧化多種底物的血紅素硫氫酸鹽類酶,在類固醇類物質合成、前致癌劑激活、藥物代謝等方面發(fā)揮重要作用,最新研究表明細胞色素P450酶也參與炎癥反應。CYP3A29是豬CYP3A亞家族的主要功能酶。豬支原體肺炎是由肺炎支原體引起的一種慢性呼吸道傳染病,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)豬CYP3A29基因表達與肺炎支原體感染引發(fā)的炎癥反應關系密切。
  目的:通過構建穩(wěn)定表達CYP3A29基因的豬肺泡巨噬細胞系,探

2、討CYP3A29基因在肺炎支原體感染炎癥反應過程的作用。
  方法:RT-PCR獲取豬CYP3A29基因序列,目的片段與pMD18-T相連,得到pMD18-T-CYP3A29重組質粒并測序驗證,用XhoⅠ和NotⅠ對重組質粒及pcDNA3.1(+)/zeo進行雙酶切,分別獲取線性DNA片段,用T4 DNA連接酶將二者連接,構建重組真核表達載體pcDNA3.1(+)/zeo-CYP3A29,并對其進行雙酶切驗證,擴增陽性克隆,提取質

3、粒,并以脂質體2000將其轉染至豬肺泡巨噬細胞系3D4/21,zeocin抗性篩選后,RT-PCR及Wesrern-blot鑒定基因表達。豬肺炎支原體感染不同處理組細胞,檢測炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及PPAR-γ受體基因的表達情況。
  結果
  1、克隆獲取豬CYP3A29基因序列,經與NCBI上相應序列比對分析,同源性達99%。
  2、成功構建CYP3A29基因真核表達載體。
  

4、3、zeocin濃度分別為50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml的完全細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞,300μg/ml組、250μg/ml組細胞分別在第5天和第7天全部死亡,200μg/ml組細胞在第11天全部死亡,此時150μg/ml組還有細胞存活。
  4、24孔板培養(yǎng)的細胞,以125ng/孔、250ng/孔、375ng/孔、500ng/孔四種不同濃度的重組DNA轉染,50

5、0ng/孔組轉染效果最好。
  5、轉染篩選到的細胞,RT-PCR檢測到目的條帶、western-blot檢測到CYP3A29的表達。
  6、Mhp刺激不同處理組PAM均能引起相關炎性因子表達上調,其中CYP3A29基因過表達組細胞IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表達量出現(xiàn)極顯著上調(P<0.01)分別出現(xiàn)在4h、8h、4h、8h,正常組細胞和空載組細胞IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表達量極顯著上調(

6、P<0.01)分別出現(xiàn)在18h、12h、12h、12h(空載組細胞未見極顯著上調);在Mhp刺激相同時間時,CYP3A29基因過表達組細胞與正常組和空載組細胞相比較IL-1β的表達量在4h、8h差異極顯著(P<0.01),12h時差異顯著(P<0.05),IL-6的表達量在8h時差異顯著(P<0.05),IL-8的表達量在4h時差異極顯著(P<0.01),8h、18h時差異顯著(P<0.05),TNF-α的表達量在8h、12h、18h時

7、差異極顯著(P<0.01)。
  7、Mhp刺激后,不同處理組細胞PPAR-γ的表達量在18h時出現(xiàn)短暫上調,且各個時間段檢測結果表明CYP3A29基因過表達組細胞PPAR-γ的表達量均顯著低于正常組和空載組細胞。
  結論:
  1、獲得了能夠用于后續(xù)實驗的CYP3A29基因CDS區(qū)片段,成功構建了含有CYP3A29基因的真核表達載體。
  2、優(yōu)化了細胞轉染體系及轉染過程中的藥物篩選濃度;成功構建了穩(wěn)定表達C

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