TNFRIBP-Fc融合蛋白治療肥胖相關的胰島素抵抗及其機制的研究.pdf

1、當今肥胖發(fā)病率越來越高，已經成為世界上普遍的社會問題之一。肥胖與胰島素抵抗密切相關，是非胰島素依耐型糖尿病發(fā)病的高危因素之一。胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是指機體對一定量胰島素的生物學反應低于正常水平,即胰島素敏感性下降，常伴隨2型糖尿病、脂代謝異常、高血壓及心血管疾病，將之統(tǒng)稱為胰島素抵抗綜合征,又稱X綜合征。
　　 TNF-α是由激活的單核/巨噬細胞、淋巴細胞等分泌的細胞因子，介導炎癥反應、免疫應

2、答、抗腫瘤等多種生物學效應。近來發(fā)現(xiàn)脂肪組織也合成和分泌TNF-α，它在胰島素抵抗的發(fā)生機制中起關鍵性作用。已知TNF-α可通過胰島素受體底物-1(IRS-1)絲、蘇氨酸磷酸化抑制其酪氨酸磷酸化，從而抑制胰島素的信號轉導，這個效應究竟是TNFRI或TNFRII介導的，現(xiàn)在尚無定論。
　　 本室前期工作從噬菌體12線肽庫中篩選出TNFRI封閉肽(blocking peptide,BP)，它可與分泌型TNF-a競爭性結合TNFRI，

3、發(fā)揮拮抗TNF-a的作用，為了增加該肽的親合力和延長其半衰期，我們將該肽的核苷酸序列插入到分泌性表達IgG1Fc段的真核表達載體pIG/3C，得到TNFRIBP和人IgG1Fc融合蛋白的表達載體pIG/3C-TNFRIBP-Fc。本課題用該載體與帶neo篩選標記的pcDNA3.1共轉染CHO-K1和BHK-21建立穩(wěn)定細胞系，得到大量純化的融合蛋白用于治療肥胖相關的胰島素抵抗，為開發(fā)治療TNF-a相關疾病的肽類藥物奠定基礎。
　　

4、 一、TNFRIBP-Fc融合蛋白的穩(wěn)定表達與純化
　　 1．建立穩(wěn)定細胞系：分別將pIG/3C-TNFRIBP-Fc和pIG/3C-IgG1Fc載體和帶有G418篩選標記的pcDNA3.1載體共轉染CHO-k1和 BHK-21細胞，經G418篩選，挑取高表達株，經三次有限稀釋，得到七株穩(wěn)定表達TNFRIBP-Fc融合蛋白的細胞系，三株穩(wěn)定表達Fc蛋白的細胞系。
　　 2．融合蛋白和Fc蛋白的純化：無血清擴大培養(yǎng)這些細

5、胞株，收集上清，經protein A-Sepharose CL-4B親和層析，得到純化的融合蛋白和Fc蛋白，經雙抗體夾心ELISA定量，證實TNFRIBP-Fc融合蛋白的平均表達效率約為500ng/ml，F(xiàn)c蛋白的平均表達效率約為400ng/ml。
　　 3．SDS-PAGE鑒定融合蛋白和Fc蛋白的分子量：SDS-PAGE顯示純化后的融合蛋白的分子量為37kD左右，F(xiàn)c蛋白的分子量大約是36kD。
　　 4．純化的融合蛋

6、白生物活性的檢測：間接免疫熒光和MTT試驗證實融合蛋白能特異性結合鼠細胞系L929細胞上的TNFRI，且160ng/ml的融合蛋白就可完全阻斷TNFRI介導的100U/ml的分泌性TNF-α(sTNF-α)引起的細胞毒效應。
　　 二、TNFRIBP-Fc融合蛋白的體外試驗
　　 1．體外誘導前脂肪細胞3T3-L1分化成脂肪細胞：前脂肪細胞系3T3L1先用0.5mM IBMX、1μM地塞米松和10μg/ml的胰島素誘導三

7、天，再用10μg/ml的胰島素誘導兩天，撤去胰島素培養(yǎng)兩天，誘導其分化成脂肪細胞的效率達90[％]以上。
　　 2．體外高糖誘導脂肪細胞胰島素抵抗：用不同濃度的葡萄糖作用上述分化的脂肪細胞24小時，結果顯示25mM的葡萄糖即可誘導分化的3T3-L1發(fā)生胰島素抵抗，表現(xiàn)為在胰島素刺激下對3H-2-脫氧葡萄糖的攝取降低150倍左右(p<0.05)。
　　 3．內源性兩型TNF-a與高糖誘導脂肪細胞胰島素抵抗的關系：用不同濃度

8、的葡萄糖作用上述分化的脂肪細胞24小時，結果顯示與15mM葡萄糖作用組相比，25mM葡萄糖誘導胰島素抵抗時，脂肪細胞表面TM-TNF-α表達從81.4[％]降至3.56[％]，而培養(yǎng)上清中sTNF-α從63.73升高113.03 (pg/ml)。在誘導胰島素抵抗的同時加入160ng/ml的融合蛋白或TACE抗體，明顯改善高糖誘導的胰島素抵抗，與25mM葡萄糖誘導抵抗組比，前者把細胞在胰島素刺激下對糖攝取提高了20倍，后者提高了50倍。<

9、br>　　 4．外源性兩型TNF-α對脂肪細胞胰島素應答的影響：分別用sTNF-α和TM-TNF-α作用分化的脂肪細胞24小時，觀察細胞在胰島素的刺激下對糖的攝取。結果顯示與未刺激的對照組比，sTNF-α使脂肪細胞對胰島素刺激的糖攝取降低了96[％]，而TM-TNF-α卻使之增加了約2倍；同時加入融合蛋白或抗TNF抗體，可幾乎完全逆轉sTNFα誘導的胰島素抵抗，同時也幾乎完全阻斷TM-TNFα提高脂肪細胞對胰島素的敏感性的作用。

10、>　　 5．兩型TNFα對脂肪細胞胰島素信號轉導的影響：分別用sTNFα和TMTNF-α作用分化的脂肪細胞24小時，用Western檢測IRS-1酪氨酸和絲氨酸磷酸化水平。結果顯示sTNFα使IRS-1270位絲氨酸磷酸化水平升高而酪氨酸磷酸化水平下降，TM-TNF-α不影響正常胰島素誘導的絲氨酸/酪氨酸磷酸化水平。
　　 三、TNFRIBP-Fc融合蛋白的體內試驗
　　 1．高糖高脂飲食建立大鼠胰島素抵抗的模型：選取

11、體重在110～120g的雄性Wistar大鼠，給與普通飲食(ND)或者高糖高脂飲食(HFS)喂養(yǎng)16周，結果顯示與普通飲食相比，高糖高脂飲食大鼠體重每月增加18[％]，血糖維持正常的同時表現(xiàn)出明顯的高胰島素血癥，胰島素抵抗指數(shù)HOMAIR升高了3倍。提示成功建立肥胖引起的胰島素抵抗。
　　 2．治療分組：第17周開始HFS組隨機分成四組：融合蛋白治療組(HFS+Fusion)、Fc蛋白治療組(HFS+Fc)、TNF-α兔多抗治療

12、組(HFS+Ab)和單純高糖高脂飲食對照組(HFS)，每只大鼠尾靜脈注射0.1ml生理鹽水含500mg純化的TNFRIBP-Fc融合蛋白或Fc蛋白或TNF-α兔多抗或0.1ml生理鹽水，每周兩次持續(xù)4周。普通飲食組(ND)保持不變。
　　 3．融合蛋白對體重、脂肪沉積和血清甘油三酯、總膽固醇的影響：HFS組體重增加值是ND組的2倍，附睪周圍脂肪組織的重量是ND組1.8倍，脂肪細胞明顯增大，血中甘油三酯水平是ND組的3.7倍。融合

13、蛋白治療明顯改善了HFS誘導的脂肪沉積和高甘油三酯血癥：體重增加值下降了26[％]，脂肪組織重量下降了30[％]，脂肪細胞體積也明顯減小，甘油三酯水平下降了54[％]。血清膽固醇水平各組沒有差異。抗體組的治療效果最好，上述指標抗體組與普通飲食組之間沒有顯著差異。
　　 4．融合蛋白對糖代謝及胰島素敏感性的影響：各組治療前后空腹葡萄糖都在正常水平，但HFS組胰島素水平、C肽和HOMAIR是ND組2倍左右，胰島代償性肥大，胰島素和葡

14、萄糖耐受實驗說明胰島素的敏感性相對ND組顯著下降。融合蛋白治療后，與HFS組比，胰島素、C肽和HOMAIR都幾乎下降了50[％]，胰島代償性肥大也得到緩解。胰島素和葡萄糖耐受試驗直接說明融合蛋白治療后胰島素敏感性顯著增加，而Fc治療則沒有效果?？贵w組治療后敏感性與普通飲食組之間幾乎沒有顯著差異。
　　 5．ELISA顯示融合蛋白治療對TNF-α蛋白水平的影響：用ELISA檢測血清和組織蛋白提取液中TNF-α的水平。結果顯示HFS

15、組血清sTNF-α和肌肉、脂肪組織中TNF-α水平都明顯增高，融合蛋白治療使血清和脂肪組織中TNF-α的水平下降50[％]，使肌肉中TNF-α的水平下降了80[％]。肝臟組織各組之間沒有差異?？贵w組脂肪和肌肉組織TNF-α的水平仍比ND組高2.5和1.4倍。
　　 6．免疫組化顯示融合蛋白對脂肪和胰腺組織TNFα蛋白水平的影響：用免疫組化比較脂肪和胰腺組織之間TNF-α表達水平。結果顯示HFS組這兩個組織TNF-α表達水平比ND

16、組明顯升高，融合蛋白和抗體治療后TNFα水平顯著下降。
　　 四、sTNFRⅡ的原核表達、活性鑒定及其多克隆抗體的制備
　　 1．sTNFRⅡ的原核表達：采用RT-PCR方法，從人外周血的單核細胞中擴增出人TNFRⅡ基因的胞外區(qū)，將其克隆入pET28a(+)高效表達載體，測序鑒定后得到正確的重組子，用IPTG誘導其表達后經鎳柱純化，得到sTNFRⅡ重組蛋白。經10[％]SDS-PAGE分析其分子量約為32kD，掃描分析，

17、其表達量占菌體蛋白總量的30[％]左右。
　　 2．純化后sTNFRⅡ的生物活性鑒定：sTNFRⅡ經western鑒定可以與TNFRⅡ的抗體結合；間接免疫熒光顯示sTNFRⅡ可以抑制GFP-sTNF-α融合蛋白與細胞表面TNFR的結合；MTT實驗顯示20μg/ml sTNFRⅡ幾乎可完全阻斷sTNF-α引起的細胞毒效應。
　　 3．多克隆抗體的制備：用純化的sTNFRⅡ與完全佛氏佐劑免疫兩只家兔后得到抗TNFRⅡ多克隆抗

18、體，效價分別為1:32000和1:16000。
　　
　　 結論：(1)成功真核表達和純化具有生物活性的融合蛋白TNFRIBP-Fc；(2)體外實驗證實融合蛋白可以改善高糖和sTNF-α誘導脂肪細胞胰島素抵抗，其作用機制主要是下調sTNF-α的表達和阻斷sTNF-α與TNFRI結合介導的胰島素抵抗；(3)兩型TNF-α在胰島素抵抗中發(fā)揮不同的作用：sTNF-α導致脂肪細胞胰島素抵抗，TMTNF-α提高脂肪細胞對胰島素的