TNFRIBP-Fc融合蛋白治療肥胖相關(guān)的胰島素抵抗及其機(jī)制的研究.pdf

1、當(dāng)今肥胖發(fā)病率越來(lái)越高，已經(jīng)成為世界上普遍的社會(huì)問(wèn)題之一。肥胖與胰島素抵抗密切相關(guān)，是非胰島素依耐型糖尿病發(fā)病的高危因素之一。胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是指機(jī)體對(duì)一定量胰島素的生物學(xué)反應(yīng)低于正常水平,即胰島素敏感性下降，常伴隨2型糖尿病、脂代謝異常、高血壓及心血管疾病，將之統(tǒng)稱為胰島素抵抗綜合征,又稱X綜合征。
　　 TNF-α是由激活的單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等分泌的細(xì)胞因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)

2、答、抗腫瘤等多種生物學(xué)效應(yīng)。近來(lái)發(fā)現(xiàn)脂肪組織也合成和分泌TNF-α，它在胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制中起關(guān)鍵性作用。已知TNF-α可通過(guò)胰島素受體底物-1(IRS-1)絲、蘇氨酸磷酸化抑制其酪氨酸磷酸化，從而抑制胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這個(gè)效應(yīng)究竟是TNFRI或TNFRII介導(dǎo)的，現(xiàn)在尚無(wú)定論。
　　 本室前期工作從噬菌體12線肽庫(kù)中篩選出TNFRI封閉肽(blocking peptide,BP)，它可與分泌型TNF-a競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TNFRI，

3、發(fā)揮拮抗TNF-a的作用，為了增加該肽的親合力和延長(zhǎng)其半衰期，我們將該肽的核苷酸序列插入到分泌性表達(dá)IgG1Fc段的真核表達(dá)載體pIG/3C，得到TNFRIBP和人IgG1Fc融合蛋白的表達(dá)載體pIG/3C-TNFRIBP-Fc。本課題用該載體與帶neo篩選標(biāo)記的pcDNA3.1共轉(zhuǎn)染CHO-K1和BHK-21建立穩(wěn)定細(xì)胞系，得到大量純化的融合蛋白用于治療肥胖相關(guān)的胰島素抵抗，為開(kāi)發(fā)治療TNF-a相關(guān)疾病的肽類藥物奠定基礎(chǔ)。
　　

4、 一、TNFRIBP-Fc融合蛋白的穩(wěn)定表達(dá)與純化
　　 1．建立穩(wěn)定細(xì)胞系：分別將pIG/3C-TNFRIBP-Fc和pIG/3C-IgG1Fc載體和帶有G418篩選標(biāo)記的pcDNA3.1載體共轉(zhuǎn)染CHO-k1和 BHK-21細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，挑取高表達(dá)株，經(jīng)三次有限稀釋，得到七株穩(wěn)定表達(dá)TNFRIBP-Fc融合蛋白的細(xì)胞系，三株穩(wěn)定表達(dá)Fc蛋白的細(xì)胞系。
　　 2．融合蛋白和Fc蛋白的純化：無(wú)血清擴(kuò)大培養(yǎng)這些細(xì)

5、胞株，收集上清，經(jīng)protein A-Sepharose CL-4B親和層析，得到純化的融合蛋白和Fc蛋白，經(jīng)雙抗體夾心ELISA定量，證實(shí)TNFRIBP-Fc融合蛋白的平均表達(dá)效率約為500ng/ml，F(xiàn)c蛋白的平均表達(dá)效率約為400ng/ml。
　　 3．SDS-PAGE鑒定融合蛋白和Fc蛋白的分子量：SDS-PAGE顯示純化后的融合蛋白的分子量為37kD左右，F(xiàn)c蛋白的分子量大約是36kD。
　　 4．純化的融合蛋

6、白生物活性的檢測(cè)：間接免疫熒光和MTT試驗(yàn)證實(shí)融合蛋白能特異性結(jié)合鼠細(xì)胞系L929細(xì)胞上的TNFRI，且160ng/ml的融合蛋白就可完全阻斷TNFRI介導(dǎo)的100U/ml的分泌性TNF-α(sTNF-α)引起的細(xì)胞毒效應(yīng)。
　　 二、TNFRIBP-Fc融合蛋白的體外試驗(yàn)
　　 1．體外誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞3T3-L1分化成脂肪細(xì)胞：前脂肪細(xì)胞系3T3L1先用0.5mM IBMX、1μM地塞米松和10μg/ml的胰島素誘導(dǎo)三

7、天，再用10μg/ml的胰島素誘導(dǎo)兩天，撤去胰島素培養(yǎng)兩天，誘導(dǎo)其分化成脂肪細(xì)胞的效率達(dá)90[％]以上。
　　 2．體外高糖誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞胰島素抵抗：用不同濃度的葡萄糖作用上述分化的脂肪細(xì)胞24小時(shí)，結(jié)果顯示25mM的葡萄糖即可誘導(dǎo)分化的3T3-L1發(fā)生胰島素抵抗，表現(xiàn)為在胰島素刺激下對(duì)3H-2-脫氧葡萄糖的攝取降低150倍左右(p<0.05)。
　　 3．內(nèi)源性兩型TNF-a與高糖誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的關(guān)系：用不同濃度

8、的葡萄糖作用上述分化的脂肪細(xì)胞24小時(shí)，結(jié)果顯示與15mM葡萄糖作用組相比，25mM葡萄糖誘導(dǎo)胰島素抵抗時(shí)，脂肪細(xì)胞表面TM-TNF-α表達(dá)從81.4[％]降至3.56[％]，而培養(yǎng)上清中sTNF-α從63.73升高113.03 (pg/ml)。在誘導(dǎo)胰島素抵抗的同時(shí)加入160ng/ml的融合蛋白或TACE抗體，明顯改善高糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗，與25mM葡萄糖誘導(dǎo)抵抗組比，前者把細(xì)胞在胰島素刺激下對(duì)糖攝取提高了20倍，后者提高了50倍。<

9、br>　　 4．外源性兩型TNF-α對(duì)脂肪細(xì)胞胰島素應(yīng)答的影響：分別用sTNF-α和TM-TNF-α作用分化的脂肪細(xì)胞24小時(shí)，觀察細(xì)胞在胰島素的刺激下對(duì)糖的攝取。結(jié)果顯示與未刺激的對(duì)照組比，sTNF-α使脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素刺激的糖攝取降低了96[％]，而TM-TNF-α卻使之增加了約2倍；同時(shí)加入融合蛋白或抗TNF抗體，可幾乎完全逆轉(zhuǎn)sTNFα誘導(dǎo)的胰島素抵抗，同時(shí)也幾乎完全阻斷TM-TNFα提高脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性的作用。

10、>　　 5．兩型TNFα對(duì)脂肪細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響：分別用sTNFα和TMTNF-α作用分化的脂肪細(xì)胞24小時(shí)，用Western檢測(cè)IRS-1酪氨酸和絲氨酸磷酸化水平。結(jié)果顯示sTNFα使IRS-1270位絲氨酸磷酸化水平升高而酪氨酸磷酸化水平下降，TM-TNF-α不影響正常胰島素誘導(dǎo)的絲氨酸/酪氨酸磷酸化水平。
　　 三、TNFRIBP-Fc融合蛋白的體內(nèi)試驗(yàn)
　　 1．高糖高脂飲食建立大鼠胰島素抵抗的模型：選取

11、體重在110～120g的雄性Wistar大鼠，給與普通飲食(ND)或者高糖高脂飲食(HFS)喂養(yǎng)16周，結(jié)果顯示與普通飲食相比，高糖高脂飲食大鼠體重每月增加18[％]，血糖維持正常的同時(shí)表現(xiàn)出明顯的高胰島素血癥，胰島素抵抗指數(shù)HOMAIR升高了3倍。提示成功建立肥胖引起的胰島素抵抗。
　　 2．治療分組：第17周開(kāi)始HFS組隨機(jī)分成四組：融合蛋白治療組(HFS+Fusion)、Fc蛋白治療組(HFS+Fc)、TNF-α兔多抗治療

12、組(HFS+Ab)和單純高糖高脂飲食對(duì)照組(HFS)，每只大鼠尾靜脈注射0.1ml生理鹽水含500mg純化的TNFRIBP-Fc融合蛋白或Fc蛋白或TNF-α兔多抗或0.1ml生理鹽水，每周兩次持續(xù)4周。普通飲食組(ND)保持不變。
　　 3．融合蛋白對(duì)體重、脂肪沉積和血清甘油三酯、總膽固醇的影響：HFS組體重增加值是ND組的2倍，附睪周圍脂肪組織的重量是ND組1.8倍，脂肪細(xì)胞明顯增大，血中甘油三酯水平是ND組的3.7倍。融合

13、蛋白治療明顯改善了HFS誘導(dǎo)的脂肪沉積和高甘油三酯血癥：體重增加值下降了26[％]，脂肪組織重量下降了30[％]，脂肪細(xì)胞體積也明顯減小，甘油三酯水平下降了54[％]。血清膽固醇水平各組沒(méi)有差異?？贵w組的治療效果最好，上述指標(biāo)抗體組與普通飲食組之間沒(méi)有顯著差異。
　　 4．融合蛋白對(duì)糖代謝及胰島素敏感性的影響：各組治療前后空腹葡萄糖都在正常水平，但HFS組胰島素水平、C肽和HOMAIR是ND組2倍左右，胰島代償性肥大，胰島素和葡

14、萄糖耐受實(shí)驗(yàn)說(shuō)明胰島素的敏感性相對(duì)ND組顯著下降。融合蛋白治療后，與HFS組比，胰島素、C肽和HOMAIR都幾乎下降了50[％]，胰島代償性肥大也得到緩解。胰島素和葡萄糖耐受試驗(yàn)直接說(shuō)明融合蛋白治療后胰島素敏感性顯著增加，而Fc治療則沒(méi)有效果。抗體組治療后敏感性與普通飲食組之間幾乎沒(méi)有顯著差異。
　　 5．ELISA顯示融合蛋白治療對(duì)TNF-α蛋白水平的影響：用ELISA檢測(cè)血清和組織蛋白提取液中TNF-α的水平。結(jié)果顯示HFS

15、組血清sTNF-α和肌肉、脂肪組織中TNF-α水平都明顯增高，融合蛋白治療使血清和脂肪組織中TNF-α的水平下降50[％]，使肌肉中TNF-α的水平下降了80[％]。肝臟組織各組之間沒(méi)有差異?？贵w組脂肪和肌肉組織TNF-α的水平仍比ND組高2.5和1.4倍。
　　 6．免疫組化顯示融合蛋白對(duì)脂肪和胰腺組織TNFα蛋白水平的影響：用免疫組化比較脂肪和胰腺組織之間TNF-α表達(dá)水平。結(jié)果顯示HFS組這兩個(gè)組織TNF-α表達(dá)水平比ND

16、組明顯升高，融合蛋白和抗體治療后TNFα水平顯著下降。
　　 四、sTNFRⅡ的原核表達(dá)、活性鑒定及其多克隆抗體的制備
　　 1．sTNFRⅡ的原核表達(dá)：采用RT-PCR方法，從人外周血的單核細(xì)胞中擴(kuò)增出人TNFRⅡ基因的胞外區(qū)，將其克隆入pET28a(+)高效表達(dá)載體，測(cè)序鑒定后得到正確的重組子，用IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)后經(jīng)鎳柱純化，得到sTNFRⅡ重組蛋白。經(jīng)10[％]SDS-PAGE分析其分子量約為32kD，掃描分析，

17、其表達(dá)量占菌體蛋白總量的30[％]左右。
　　 2．純化后sTNFRⅡ的生物活性鑒定：sTNFRⅡ經(jīng)western鑒定可以與TNFRⅡ的抗體結(jié)合；間接免疫熒光顯示sTNFRⅡ可以抑制GFP-sTNF-α融合蛋白與細(xì)胞表面TNFR的結(jié)合；MTT實(shí)驗(yàn)顯示20μg/ml sTNFRⅡ幾乎可完全阻斷sTNF-α引起的細(xì)胞毒效應(yīng)。
　　 3．多克隆抗體的制備：用純化的sTNFRⅡ與完全佛氏佐劑免疫兩只家兔后得到抗TNFRⅡ多克隆抗

18、體，效價(jià)分別為1:32000和1:16000。
　　
　　 結(jié)論：(1)成功真核表達(dá)和純化具有生物活性的融合蛋白TNFRIBP-Fc；(2)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)融合蛋白可以改善高糖和sTNF-α誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞胰島素抵抗，其作用機(jī)制主要是下調(diào)sTNF-α的表達(dá)和阻斷sTNF-α與TNFRI結(jié)合介導(dǎo)的胰島素抵抗；(3)兩型TNF-α在胰島素抵抗中發(fā)揮不同的作用：sTNF-α導(dǎo)致脂肪細(xì)胞胰島素抵抗，TMTNF-α提高脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的