α-干擾素聯(lián)合化療藥物對肝癌細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路的干預(yù)作用及其機(jī)制.pdf

1、肝癌是我國最為常見的惡性腫瘤之一，國際抗癌研究中心(IARC)估計(jì)每年全球肝癌新發(fā)病例約56.4萬，肝癌死亡病例約54.9萬，其中中國肝癌新發(fā)病例30.6萬，死亡病例30.0萬。由此可見，中國的肝癌發(fā)病(死亡)數(shù)就占了全球所有肝癌病例的一半還要多。肝癌在我國發(fā)病率為癌癥中第三位(肺、胃、肝)，其死亡率為第二位(肺、肝、胃)，在各種腫瘤中它的惡性程度很高，對健康的危害是很大的。肝癌的治療在早期多以手術(shù)治療輔助放化療，中晚期的肝癌主要以放化

2、療為主，目前臨床的化療方案多是聯(lián)合化療，存在副作用大及耐藥增多等現(xiàn)象。IFN-α聯(lián)合5-FU最早被應(yīng)用于結(jié)腸癌的治療，并取得了一定的效果。后來這種聯(lián)合治療方法被應(yīng)用于食道癌和胃癌等，均取得了滿意的效果。關(guān)于IFN-α聯(lián)合5-FU作用機(jī)制的研究報(bào)道較少，研究前景廣闊。 干擾素(interferon，IFN)是細(xì)胞對相關(guān)刺激反應(yīng)時(shí)所產(chǎn)生的細(xì)胞信號(hào)蛋白質(zhì)，是細(xì)胞因子超家族中一個(gè)糖蛋白類同源細(xì)胞因子家族，稱為IFN家族。目前已鑒定出該家

3、族中的3個(gè)主要成員：IFN-α、IFN-β和IFN-γ。IFN-α由白細(xì)胞和原始淋巴細(xì)胞分泌，現(xiàn)已通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)，并被廣泛應(yīng)用于治療白血病、淋巴瘤、實(shí)體瘤及病毒、原蟲、寄生蟲和真菌感染，其治療策略包括使用IFN-α單一治療、輔助治療和維持治療。近期研究表明，IFN-α與其受體結(jié)合后，可激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，影響腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而發(fā)揮其抗腫瘤、抗增殖及免疫調(diào)節(jié)的生物學(xué)功能。 5-FU屬于抗代謝抗腫瘤藥，能抑制胸腺

4、嘧啶核苷酸合成酶，阻斷脫氧嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)換成胸腺嘧啶核苷酸，干擾DNA的合成，對RNA的合成也有一定的抑制作用，是惡性腫瘤化學(xué)治療的常用藥物。最近的研究發(fā)現(xiàn)，5-FU對腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)也有影響。主要涉及到Fas/FasL、NF-кB和caspase-8、Bcl-2家族、線粒體膜電位等的變化。但在不同細(xì)胞系間存在差異，且體外研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)應(yīng)用5-FU時(shí)，效應(yīng)劑量較大，細(xì)胞毒作用明顯。 一、研究目的： 本研究以肝癌細(xì)胞Hep

5、G2.2.15為研究對象，通過IFN-α和5-FU對肝癌細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路中的Bcl-xL、Fas、Caspase-8和BID及細(xì)胞周期調(diào)控的研究，揭示兩者的作用機(jī)制，并確定兩者聯(lián)合應(yīng)用是否存在協(xié)同作用，從而減少5-FU的用量，降低其毒副作用，為臨床應(yīng)用細(xì)胞因子和化療藥物聯(lián)合治療抗腫瘤、促凋亡提供理論依據(jù)。 二、研究方法： (1)用MTT法觀察化療藥5-FU和IFN-α對HepG2.2.15細(xì)胞增殖的影響，并篩選聯(lián)合用

6、藥的最佳劑量。IFN-α和5-FU單用藥組各設(shè)立6組不同濃度，作用48小時(shí)。根據(jù)單用藥組的增殖抑制情況選擇合適的聯(lián)合用藥組藥物濃度，進(jìn)行動(dòng)力學(xué)觀察。 (2)流式細(xì)胞術(shù)檢測藥物作用前后肝癌細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡變化：根據(jù)MTT結(jié)果篩選合適的藥物濃度進(jìn)行分組：對照組，IFN-α組，5-FU組，IFN-α+5-FU聯(lián)合用藥組。藥物作用24h后，觀察細(xì)胞周期變化；48h后觀察細(xì)胞凋亡的改變。 (3)流式細(xì)胞術(shù)檢測藥物作用前后肝癌細(xì)胞

7、表面Fas表達(dá)變化：分組情況同(2)，藥物作甩48h后收集細(xì)胞觀察結(jié)果。 (4)RT-PCR檢測藥物作用凋亡抑制基因Bcl-XL表達(dá)變化：分組情況同(2)，藥物作用48h后收集細(xì)胞RT-PCR檢測。 (5)WesternBlot檢測藥物作用前后Caspase-8、BID、Cytc的變化。分組情況同(2)，藥物作用72小時(shí)后，收集各組細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白檢測。 (6)應(yīng)用Fluo-3/AM熒光標(biāo)記技術(shù)和激光掃描共聚焦

8、顯微鏡(LSCM)檢測不同組處理的HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的改變。 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.IFN-α單獨(dú)應(yīng)用對HepG2.2.15細(xì)胞的增殖抑制作用較弱，最大濃度時(shí)對細(xì)胞的增殖抑制率僅為17.1％。5-FU單用藥組的增殖抑制作用較強(qiáng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果選擇聯(lián)合用藥5-FU的濃度為10μg/mL，IFN-α的濃度為4000U/mL，兩藥聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對細(xì)胞的增殖抑制作用明顯增強(qiáng)，與單用藥組比較差異顯著，P＜0.01，

9、兩者存在協(xié)同作用。 2.兩者聯(lián)合應(yīng)用對HepG2.2.15細(xì)胞周期的影響表現(xiàn)為與對照組和IFN-α、5-FU單用藥組相比，聯(lián)合用藥組G0/G1期細(xì)胞比率升高(54.95％、60.08％、72.50％)，S期比率降低(29.04％、18.69％、17.44％)，差異有顯著性，P＜0.01；經(jīng)藥物處理48小時(shí)后，IFN-α組細(xì)胞凋亡率為7.15％±2.23％，5-FU組為20.42％±2.67％，明顯高于對照組的4.23％±2.01

10、％，P＜0.05，而聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率為25.08％±2.54％，與對照組及IFN-α和5-FU單獨(dú)應(yīng)用組相比，細(xì)胞凋亡率明顯增高，均為P＜0.01。 3.肝癌細(xì)胞HepG2.2.15表面Fas的表達(dá)較低，僅為1.79％。IFN-α對細(xì)胞表面Fas表達(dá)沒有影響，而5-FU則可提高細(xì)胞表面Fas的表達(dá)(6.91％)，兩者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)細(xì)胞表面Fas的表達(dá)率升高為8.75％，與對照組和單用藥組比較P＜0.01. 4.聯(lián)合用藥

11、組HepG2.2.15細(xì)胞Bcl-xL基因的表達(dá)較對照組和單藥組明顯下降；凋亡調(diào)控蛋白Caspase-8、Bid的活化增加，Cytc表達(dá)增強(qiáng)，聯(lián)合用藥組和對照組及單用藥組差異有顯著性(P＜0.05)。 5.IFN-α作用于肝癌細(xì)胞HepG2.2.1524h后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度由對照組的11.6±9.3增加到37.1±10.1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；5-FU組鈣離子熒光強(qiáng)度與對照組比較無明顯變化。聯(lián)合用藥組的鈣離

12、子熒光強(qiáng)度為68.3±9.5，與IFN-α單用藥組和對照組比較明顯升高，差異有顯著性(P＜0.01). 四、結(jié)論： 1.IFN-α單獨(dú)應(yīng)用時(shí)對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用較弱，但與5-FU聯(lián)合應(yīng)用可顯著提高對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用。 2.IFN-α和5-FU均可抑制肝癌細(xì)胞周期，并促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，其中協(xié)同用藥組較單藥組有更明顯的作用，說明IFN-α和5-FU在對肝癌細(xì)胞周期影響和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡方面存在著明顯的協(xié)同

13、作用。 3.在對肝癌細(xì)胞表面Fas表達(dá)的檢測中我們發(fā)現(xiàn)，5-FU可在一定程度上提高其Fas的表達(dá)，而IFN-α的作用不明顯，兩者有一定協(xié)同作用。 4.在基因水平，我們檢測了在內(nèi)源性凋亡途徑中發(fā)揮作用的抗凋亡基因Bcl-xL在用藥前后的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)兩種藥物均可引起B(yǎng)cl-xL的表達(dá)改變，兩藥聯(lián)合時(shí)具有協(xié)同作用。凋亡相關(guān)蛋白Caspase-8、Bid的活化明顯增強(qiáng)，Cytc表達(dá)增加。說明IFN-α聯(lián)合5-FU可通過調(diào)節(jié)兩條