JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在去甲斑蝥素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前在肝癌的治療中還存在早期診斷困難，根治性切除機(jī)會(huì)小，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，對(duì)放化療不敏感，總體療效欠佳的現(xiàn)狀。去甲斑蝥素（norcantharidin NCTD）是斑蝥素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中去除1，2位甲基人工合成而得的衍生物。臨床上主要用于食管癌、膽管癌及乳腺癌等的治療，尤其在肝癌中的治療效果較好。有實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為NCTD可以通過(guò)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡起到

2、抗腫瘤的作用，但其引起凋亡的具體機(jī)制尤其是哪些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與其中尚有待進(jìn)一步闡明。其中c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-teminal Kinase，JNK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與核轉(zhuǎn)錄因子-kappaB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)控細(xì)胞凋亡的機(jī)制中研究較多。我們通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究，探討NCTD對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡影響及JNK與NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在其中發(fā)揮的作用。
　　 目的:本實(shí)

3、驗(yàn)主要通過(guò)不同濃度的NCTD干預(yù)體外培養(yǎng)的人肝肝癌細(xì)胞SMMC-7721，研究其對(duì)活化的肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響;以及JNK與NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在其中可能的作用機(jī)制。
　　 方法:應(yīng)用MTT法檢測(cè)NCTD對(duì)活化的肝癌細(xì)胞增殖的影響;Hoechst33342染色熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化;流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;以Western blot法檢測(cè)JNK、p-JNK、NF-κBp65及IκBα蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:<

4、br>　　 1、去甲斑蝥素對(duì)SMMC-7721增殖的影響
　　 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖顯示，對(duì)照組與不含DMSO組A492值無(wú)差別(p＞0.05)，說(shuō)明0.05％DMSO對(duì)SMMC-7721增殖沒(méi)有影響;不同濃度的去甲斑蝥素(5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml)分別作用12h、24h、36h、48h與各時(shí)間對(duì)照組相比A492值明顯降低，對(duì)照組的A492值總體均數(shù)與不同濃度的去甲斑蝥素組的

5、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);不同時(shí)間與濃度的去甲斑蝥素的作用對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率具有一定的時(shí)間和劑量依賴性。48h時(shí)抑制最強(qiáng)且IC50約為40μg/ml。
　　 2、去甲斑蝥素對(duì)SMMC-7721凋亡的影響
　　 2.1、Hoechest33342染色熒光顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞凋亡形態(tài)顯示:對(duì)照組細(xì)胞大小均勻，NCTD干預(yù)SMMC-7721后，細(xì)胞核濃縮、凋亡小體出現(xiàn)，說(shuō)明NCTD可誘導(dǎo)活化的肝癌細(xì)胞凋亡，除無(wú)DMSO組與

6、對(duì)照組間凋亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05);其他各組在加入40μg/mlNCTD作用不同時(shí)間(12h，24h，36h，48h)后細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。說(shuō)明DMSO對(duì)肝星狀細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響，去甲斑蝥素對(duì)肝癌細(xì)胞有促進(jìn)凋亡的作用，且與藥物作用時(shí)間有關(guān)，作用時(shí)間越長(zhǎng)凋亡率越高，12h開(kāi)始增高(11.2％±0.20％)，48h明顯增多(34.13％±1.00％)。
　　 2.2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)

7、果示:DMSO組與對(duì)照組間凋亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)，其他各組作用48h后細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。去甲斑蝥素對(duì)肝癌細(xì)胞有促進(jìn)凋亡的作用，且與藥物濃度有關(guān)，濃度越高作用越強(qiáng)。在加入NCTD前1h預(yù)先加入JNK特異性阻斷劑SP600125后，細(xì)胞凋亡率（19.60％±0.70％）較40μg/mlNCTD組（25.63％±1.12％）有所下降(p＜0.05)。表明SP600125可一定程度抑制去甲斑蝥素的促

8、凋亡作用。
　　 3、去甲斑蝥素及SP600125對(duì)SMMC-7721細(xì)胞中JNK與NF-κB信號(hào)通路的影響
　　 3.1、DMSO對(duì)細(xì)胞各通路影響結(jié)果分析:Western blot結(jié)果顯示，無(wú)DMSO組與對(duì)照組間各蛋白表達(dá)灰度值無(wú)明顯差異(p＞0.05)，說(shuō)明DMSO對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的JNK與NF-κB兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路無(wú)明顯影響。
　　 3.2、NCTD及SP600125對(duì)JNK信號(hào)通路影響:對(duì)JNK信

9、號(hào)通路蛋白灰度值分析顯示，除DMSO組外，其他各組與對(duì)照組間p-JNK的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，且隨藥物濃度升高p-JNK的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，當(dāng)在藥物組預(yù)先加入SP600125后，p-JNK的表達(dá)較40μg/mlNCTD組明顯下降。而JNK的表達(dá)在各組間無(wú)明顯變化。說(shuō)明，NCTD在對(duì)SMMC-7721的作用中使JNK的活化增加，而SP600125可有效抑制NCTD對(duì)其的活化。
　　 3.3、NCTD及SP600125對(duì)NF

10、-κB信號(hào)通路影響:對(duì)NF-κB信號(hào)通路蛋白灰度值分析顯示，除DMSO組外，其他各組與對(duì)照組間核蛋白NF-κBp65及胞漿IκBα蛋白的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，且隨藥物濃度升高NF-κBp65及IκBα的表達(dá)都逐漸降低，當(dāng)藥物組預(yù)先加入SP600125后，NF-κBp65及IκBα的表達(dá)較40μg/mlNCTD組有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。NCTD在對(duì)SMMC-7721的作用中使NF-κB的活化降低，而SP60

11、0125在有效抑制JNK活化的同時(shí)，對(duì)NF-κB也起到了一定促進(jìn)活化的作用。
　　 結(jié)論:
　　 1、體外細(xì)胞培養(yǎng)研究結(jié)果表明，去甲斑蝥素可抑制活化SMMC-7721細(xì)胞的增殖，其抑制作用具有一定時(shí)間-劑量效應(yīng)。
　　 2、去甲斑蝥素可誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡，且其在促進(jìn)細(xì)胞凋亡中具有一定的時(shí)間與劑量依賴性。
　　 3、去甲斑蝥素通過(guò)促進(jìn)JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化與抑制NF-κB活性促進(jìn)SMMC-77