LAIR家族的表達(dá)及其對(duì)LPS誘導(dǎo)DC產(chǎn)生促炎因子的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、白細(xì)胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體（Leukocyteassociatedimmunoglobulinlike-receptor，LAIR）屬于免疫球蛋白超家族成員。它是1983年用大顆粒淋巴細(xì)胞免疫小鼠，制備對(duì)NK細(xì)胞殺傷有抑制作用的抗體時(shí)發(fā)現(xiàn)的。人LAIR家族包含LAIR-1和LAIR-2兩個(gè)成員。在第八屆人類白細(xì)胞分化抗原會(huì)議上分別被命名為CD305及CD306。人LAIR基因位于人19號(hào)染色體（19q13.42）上被稱為白細(xì)胞免疫球蛋白

2、樣受體復(fù)合體（LeukocyteIg-likereceptorcomplex，LRC）中。LAIR-1和LAIR-2基因轉(zhuǎn)錄方向相反。LAIR-1cDNA全長(zhǎng)1728bp，有4個(gè)不同的異型。人LAIR-1是一個(gè)含有287個(gè)氨基酸的Ⅰ型跨膜糖蛋白，胞膜外區(qū)有一個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域，胞漿區(qū)含有兩個(gè)免疫受體酪氨酸抑制性模體（immunoreceptortyrosine-basedinhibitorymotifs，ITIMs）。LAIR-2基因編碼的

3、蛋白質(zhì)與LAIR-1胞膜外區(qū)有近84％的同源性，含有135個(gè)氨基酸，沒有跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)域，為一種分泌蛋白，LAIR-2有3個(gè)不同的異型。編碼小鼠LAIR-1（mLAIR-1）的基因位于小鼠7號(hào)染色體的最末端，相當(dāng)于人的LRC所處的19q13.42區(qū)域。人LAIR-1與LAIR-2有相似的表達(dá)特點(diǎn)，主要表達(dá)于造血細(xì)胞。用抗體交聯(lián)人LAIR-1，其胞漿區(qū)可募集酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2，轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制性信號(hào)，抑制細(xì)胞功能。小鼠LAIR

4、-1與人LAIR-1有相似的結(jié)構(gòu)特征，在氨基酸水平有40％的同源性。它也廣泛表達(dá)于各種免疫細(xì)胞，介導(dǎo)抑制性功能。特異性抗體交聯(lián)小鼠LAIR-1，胞漿區(qū)ITIM被磷酸化后可募集SHP-2，但不募集SHP-1。
　　2006年，Mayaard研究小組首次發(fā)現(xiàn)了膠原是人LAIR-1的功能性高親和力配體。它們之間的相互作用依賴于保守的甘氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸的膠原重復(fù)序列。最近，他們又在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)LAIR-2與LAIR-1有相同的膠原

5、結(jié)合位點(diǎn)，LAIR-2能夠以高親和力結(jié)合膠原，并可阻斷LAIR-1與膠原的結(jié)合。小鼠LAIR-1可以高親和力結(jié)合多種型別的膠原分子，同樣，mLAIR-1與配體的相互作用也依賴于保守的甘氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸的膠原重復(fù)序列。
　　LAIR-1與膠原之間的相互作用可受到可溶型分子的調(diào)控。sLAIR-1及LAIR-2分子可以阻斷膜型LAIR-1與膜型或細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原分子結(jié)合。而且LAIR-2與膠原的親和力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于sLAIR-1與膠

6、原結(jié)合的親和力，因此，在體內(nèi)LAIR-2很可能作為人膜型LAIR-1受體的競(jìng)爭(zhēng)分子，從而調(diào)節(jié)LAIR-1的抑制活性。
　　本研究中首先構(gòu)建了pIg/3C-LAIR-2及pcDNA3.1-LAIR-2真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，經(jīng)克隆化篩選建立了穩(wěn)定表達(dá)LAIR-2-Fc融合蛋白及LAIR-2全長(zhǎng)分子的細(xì)胞株。利用ProteinA親和層析柱及LAIR-2單克隆抗體交聯(lián)的親和層析柱，從細(xì)胞培養(yǎng)上清中分別純化到LAIR-2-Fc融合蛋

7、白及LAIR-2全長(zhǎng)分子。為夾心ELISA檢測(cè)人標(biāo)本準(zhǔn)備了標(biāo)準(zhǔn)品蛋白。利用流式細(xì)胞術(shù)及免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)鑒定了表達(dá)的LAIR-2蛋白分子與原核表達(dá)LAIR-2抗原制備的單克隆抗體具有良好的結(jié)合活性。
　　應(yīng)用優(yōu)化的ELISA試劑盒，發(fā)現(xiàn)炎癥病人的血清中可溶型LAIR分子水平高于正常人。孕婦的血清和尿中LAIR-2水平以及尿中的sLAIR-1水平高于對(duì)照組。對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，sLAIR-1和LAIR-2之間以及LAIR分子在血清中及尿中的

8、水平都呈正相關(guān)。利用免疫組織化學(xué)技術(shù)，我們用LAIR-1-Fc融合蛋白及LAIR-2-Fc融合蛋白在胎盤組織切片中進(jìn)行了染色，發(fā)現(xiàn)LAIR-2以高親力結(jié)合胎盤組織基底膜，提示LAIR-2與sLAIR-1一起可能通過(guò)與膜型LAIR-1競(jìng)爭(zhēng)相同的配體來(lái)調(diào)節(jié)LAIR-1的免疫抑制功能。
　　應(yīng)用免疫組織化學(xué)及激光共聚焦顯微鏡技術(shù)，我們研究了非造血組織中LAIR-1的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)LAIR-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有選擇性表達(dá)，而且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中L

9、AIR-1與小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子共表達(dá)于同一種細(xì)胞，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中，小膠質(zhì)細(xì)胞的LAIR-1表達(dá)水平明顯增高。
　　Toll樣受體是參與固有免疫應(yīng)答抵抗病原微生物并誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要分子。TLR4是識(shí)別細(xì)菌LPS，介導(dǎo)抗菌炎癥反應(yīng)的重要分子。它高表達(dá)于單核/巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及腸道上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。過(guò)高水平的LPS在體內(nèi)可誘導(dǎo)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，甚至發(fā)生敗血癥性休克。目前，對(duì)于TLR4介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以

10、及生理病理反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用十分關(guān)注。為了弄清共表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞表面的LAIR-1與TLR4在功能上的相互關(guān)系，我們對(duì)LAIR-1調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)DC細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子進(jìn)行了研究。我們首先制備了3株大鼠抗小鼠LAIR-1單克隆抗體并進(jìn)行了初步鑒定，發(fā)現(xiàn)3株抗體中的FMU-mLAIR-1.2可以用于Westernblot、流式細(xì)胞術(shù)分析及免疫細(xì)胞化學(xué)研究。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用固相化的FMU-mLAIR-1.2抗體交聯(lián)小鼠樹突狀細(xì)胞系DC2.4