豬繁殖與呼吸綜合征病毒2b蛋白穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的建立.pdf

1、目的:建立2b蛋白穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。
　　方法:提取PRRSVCC-1株的總RNA，登陸Genebank，根據(jù)其公布的PRRSVCC-1株的堿基序列，應(yīng)用Primer5與Oligo6軟件設(shè)計(jì)一對2b基因的特異性引物。摸索PCR擴(kuò)增條件擴(kuò)增成功后，凝膠電泳并回收目的片段。將該片段與pMD18-T克隆載體相連。轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。篩選轉(zhuǎn)化成功的陽性克隆菌。提取質(zhì)粒，并進(jìn)行PCR和單雙酶切鑒定。鑒定成功后送至測序。構(gòu)建2b

2、蛋白基因的原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體:酶切構(gòu)建成功的pMD18-T-2b重組質(zhì)粒，構(gòu)建pET-30a-2b和pEGFP-N1-2b重組質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中。篩選成功的pET-30a-2b/BL21陽性菌株在IPTG終濃度為1mM，28℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過蛋白電泳SDS-PAGE鑒定正確后，運(yùn)用Ni2+親和層析法在自然條件下純化重組蛋白，免疫家兔，制備多克隆抗體，進(jìn)行Western-Blot鑒定。pEGFP-N

3、1-2b/BL21陽性菌株鑒定完成后，大量提取質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，在熒光倒置顯微鏡下觀察。轉(zhuǎn)染后進(jìn)行細(xì)胞株篩選，進(jìn)行目的基因轉(zhuǎn)錄、Western-Blot。
　　結(jié)果:
　　1、成功克隆了PRRSV2b蛋白目的基因。該片段堿基序列為222bp，編碼73個(gè)氨基酸。
　　2、成功構(gòu)建了pET-30a-b/BL21原核表達(dá)載體，蛋白電泳SDS-PAGE鑒定所表達(dá)的蛋白大小為17