桑葉中PPARγ激動劑活性組分的分離和篩選.pdf

1、糖尿病是一種代謝性疾病，它的主要特點是高血糖。糖尿病患者長期存在高血糖，會使各種組織器官，尤其是眼、腎臟、心臟、血管、神經(jīng)等功能的慢性損害。桑葉具有良好的治療糖尿病效果，我國是產(chǎn)桑大國，桑葉中提取的提取物質(zhì)，如總多糖，黃酮和生物堿的抗血糖功能被廣泛的研究，而桑葉也常與其他中藥配伍治療糖尿病。
　　PPARγ是核受體超家族成員，PPARγ激活后通過相關(guān)調(diào)節(jié)可以促進脂聯(lián)素分泌，增加機體對胰島素的敏感性。通過PPARγ信號通路，改善胰島

2、素抵抗，是目前人們研究抗糖藥物的一種有效途徑。PPARγ與激活劑結(jié)合后被激活，會和RXR形成異源二聚體，與靶基因啟動子上游的反應元件PPRE結(jié)合，調(diào)控熒光素酶報告基因的表達水平。本研究利用這個原理，旨在建立一種簡單、高效、靈敏的高通量篩選PPA Rγ配體的Cos-7細胞模型，并運用于桑葉中的小分子活性物質(zhì)的篩選。
　　本研究構(gòu)建重組表達載體pEGFP-N2-PPARγ，pGL4-PPRE4-1uc。利用lipofectamine2

3、000，采用共轉(zhuǎn)染的方式將兩個質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞，并對細胞模型進行優(yōu)化處理，最終選定細胞匯合度為70％，pEGFP-N2-PPARγ與pGL4-PPRE4-1uc的質(zhì)粒濃度比為2∶1，轉(zhuǎn)染時間為20 h，藥物孵育時間為24 h。利用PPARγ陽性配體羅格列酮檢測模型的穩(wěn)定性和特異性，結(jié)果顯示模型的穩(wěn)定性良好，且僅對羅格列酮有激活效應并在一定范圍內(nèi)呈劑量效應關(guān)系，而對其他配體沒有激活效應。通過以上驗證證明PPARγ配體高通量篩選細胞模型已經(jīng)成構(gòu)

4、建，可用于桑葉中小分子活性物質(zhì)的初步篩選。
　　本研究利用正己烷粗提桑葉中的有效成分，運用硅膠柱層析和薄層層析初步分離正己烷初提物，得到Fr.PE-1到Fr.PE-40四十個分離樣品。利用Cos-7細胞模型，檢測40個組分的活性，發(fā)現(xiàn)其中6個組分活性較好。將6個組分進行堿法衍生，并用GC-MS分析組分的脂肪酸構(gòu)成。通過檢測，我們共從桑葉中獲得18種脂肪酸。將脂肪酸用Cos-7細胞模型分析，結(jié)果顯示十四酸，十五酸，亞麻酸均有PPAR

5、γ激活作用，其他脂肪酸均無作用。其中當十四酸的濃度為100μmol/L、十五酸濃度為50μmol/L、亞麻酸濃度為150μmol/L、亞油酸濃度為100Ⅲmol/L時，其激活倍數(shù)達到最大，分別為1.51倍、2.12倍、2.48倍和2.21倍。利用標準品繪制標準曲線，發(fā)現(xiàn)干燥桑葉中亞麻酸占1.91％，亞油酸占0.94％，十四酸占0.11％。
　　桑葉中的PPARγ活性激動劑的分離和篩選為尋找新的天然的胰島素增敏劑，合成新型PPARγ