Neuromedin U2受體激動劑高通量篩選模型與天然產物活性成分研究.pdf

1、化合物活性篩選是創(chuàng)新藥物研究的起點和具有決定意義的步驟，是源頭創(chuàng)新和持續(xù)創(chuàng)新的關鍵。離開篩選，就無從發(fā)現(xiàn)具有某種特定生物活性的新型化學物質，新藥的研究開發(fā)就將成為無源之水。但是，這種基本技術能力恰恰是我國創(chuàng)新藥物研制中最為突出的薄弱環(huán)節(jié)，成為制約醫(yī)藥工業(yè)轉型的“瓶頸”之一。傳統(tǒng)的動物篩選模式勞動強度大，效率低。近年來，隨著分子生物學、分子藥理學和自動化技術的發(fā)展，高通量藥物篩選(Highthroughputscreening，HTS)成

2、為藥物早期發(fā)現(xiàn)的重要手段，它是利用藥靶的分子或細胞水平的生物學機制，以微孔板為基礎，進行大量篩選，找到能選擇性作用于藥靶的活性化合物，具有微量、快速、靈敏、準確等優(yōu)點。 NeuromedinU(NMU)是高效表達在腸道和中樞神經系統(tǒng)的一種神經多肽，大鼠禁食48小時后下丘腦中NMU的mRNA水平降低，提示該神經多肽可能涉及飲食行為。事實上，在大鼠腦內注射NMU將降低其食欲。已發(fā)現(xiàn)孤兒G蛋白偶聯(lián)受體FM-4是NMU的一個內源受體(取

3、名為NMU2受體或NMU2R)，雜交分析表明，NMU2受體高效表達在下丘腦的室旁核，屬Gq蛋白偶聯(lián)受體，用NMU激活NMU2受體轉染的HEK293細胞株能增加細胞內的鈣信號。為了進一步了解NMU2受體的生理功能和開展抗肥胖新藥研究，作者建立了NMU2受體激動劑的高通量篩選模型，并以天然產物為資源，篩選和鑒定了NMU2受體的激動劑。 建立了人NMU2受體基因質粒(hNMU2R/pcDNA3.1)和一個能同時響應Gs、Gi和Gq受體

4、的報告基因質粒(MRE/CRE/SRE/LUC)，并將NMU2受體質粒和報告基因質粒共轉染到HEK293細胞，通過G418篩選，建立了穩(wěn)定的hNMU2受體激動劑篩選細胞株。當化合物與膜表面的NMU2受體結合后，激活NMU2受體對應的信號級聯(lián)反應，改變胞內第二信使的表達水平，響應元件響應這種變化，促進報告基因的表達，通過檢測細胞質中報告基因的表達量，間接評估化合物的生物活性。 為了有效排除篩選過程中的假陽性和假陰性，同時建立了只含

5、報告基因質粒的陰性細胞株和其它受體(MC4R、M1R)篩選細胞株。 利用cAMP響應元件CRE的激活劑Forskolin和受體內源激動劑探索和優(yōu)化了熒光素酶表達時間、每孔細胞數(shù)目、溶劑DMSO終濃度、熒光素酶底物濃度等篩選實驗條件，建立了可靠的篩選方法。結果顯示，NMU2R、MC4R、M1R篩選細胞株最適宜條件為：細胞數(shù)目4～8×104個/孔、激動劑孵育時間6～8h、每孔DMSO終濃度小于1％、熒光素酶底物終濃度為12.5％(V

6、％)；篩選模型Z'-因子分別為0.75、0.67和0.7，適用于NMU2R、MC4R和M1R激動劑的高通量篩選。 利用建立的篩選模型，對211種天然產物水提物進行了小規(guī)模篩選，發(fā)現(xiàn)127種天然產物水提物對NMU2受體有活性，通過對其中部分天然產物分離、純化及鑒定，發(fā)現(xiàn)一些具有特殊結構的黃酮甙化合物激活或部分激活NMU2受體，但它們不能激活MC4、M1受體細胞株和陰性細胞株響應，提示這些黃酮甙化合物可能是NMU2受體的激動劑或部分