Caco-2細(xì)胞模型的建立及在口服藥物吸收中的應(yīng)用.pdf

1、Caco-2細(xì)胞來源于人結(jié)腸腺癌細(xì)胞,在培養(yǎng)條件下形成極性單細(xì)胞層，具有微絨毛以及緊密連接等類似于人體小腸上皮細(xì)胞刷狀緣側(cè)的分化特征。接種到碳酸聚酯多孔膜等基質(zhì)上,可分化出腸腔側(cè)(Apical，AP側(cè))和腸內(nèi)壁側(cè)(Basolate ral，BL側(cè))。AP側(cè)含有典型的小腸微絨毛水解酶、CYP1A1、β-葡萄糖醛酸糖苷酶和包括P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的各種營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體,可發(fā)揮主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)作用，并且Caco-2

2、細(xì)胞保留了P-gp高表達(dá)特性，P-糖蛋白是一種170Kd大小的多藥耐藥基因(MDR1)調(diào)控的外排蛋白，主要功能是外排各種外來異物，保護(hù)機(jī)體不受外來異物的侵?jǐn)_。其“藥物溢出泵”(drug efflux pump)作用是導(dǎo)致藥物低生物利用度的主要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)正常組織細(xì)胞中如人體的胃腸道上皮細(xì)胞、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、腎、血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞P-糖蛋白廣泛存在。目前，Caco-2細(xì)胞模型被認(rèn)為是研究口服藥物在吸收過程中相互作用的有效模型。作為藥物吸

3、收研究的一種快速篩選工具，Caco-2細(xì)胞模型廣泛用于研究藥物的代謝、吸收機(jī)制、及藥物毒性等，此細(xì)胞具有與小腸上皮細(xì)胞相同的細(xì)胞極性和緊密連接，可以模擬小腸上皮細(xì)胞吸收特性。本論文建立了體外培養(yǎng)的Caco－2細(xì)胞模型，并應(yīng)用此模型對(duì)藥物輔料進(jìn)行體外篩選，尋找可能的P-gp抑制劑，在此基礎(chǔ)上研究低生物利用度藥物吸收的影響，為提高其生物利用度提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 1. Caco－2細(xì)胞模型的建立與評(píng)價(jià)
　　 1.1目的：建

4、立Caco－2單層細(xì)胞模型用以模擬小腸上皮，并且應(yīng)用此模型對(duì)促進(jìn)低生物利用度藥物更昔洛韋吸收的輔料進(jìn)行篩選。評(píng)價(jià)Caco－2細(xì)胞的正常生長特性，以及可以在日常培養(yǎng)中對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行監(jiān)控。
　　 1.2材料：實(shí)驗(yàn)所用Caco－2細(xì)胞來自武漢大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)中心。實(shí)驗(yàn)所用代數(shù)在40—60代之間。培養(yǎng)液為DMEM（4.5g/lD-glucose），含1%非必需氨基酸，1%L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素，10%胎牛血

5、清（FBS）0.25％胰蛋白酶溶液，Millicell抵入式培養(yǎng)器（美國Millipore公司）。
　　 1.3方法：
　　 1.3.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：將細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，隔天換液，培養(yǎng)14天，用顯微鏡觀察并做透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。
　　 1.3.2 TEER值的測(cè)定：在進(jìn)行藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)之前，用細(xì)胞電阻儀測(cè)定跨上皮細(xì)胞電阻(transepithelium electrical resistance，T

6、EER)，確定細(xì)胞單層的完整性。
　　 1.3.3 堿性磷酸酶活性的測(cè)定：本文采用ALP/AKP試劑盒考察Caco-2細(xì)胞單層的堿性磷酸酶的活性，評(píng)價(jià)Caco一2細(xì)胞的生長分化特征。
　　 1.3.4苯酚紅通透性的測(cè)定：將苯酚紅作為Caco一2細(xì)胞單層模型跨細(xì)胞被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的標(biāo)記物，在pH7.2～7.4的情況下進(jìn)行苯酚紅從細(xì)胞模型頂側(cè)AP到基底側(cè)BL的轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)，計(jì)算苯酚紅跨膜通量，確定細(xì)胞單層的完整性和緊密性。
　　

7、 1.4結(jié)論：采用光鏡，電鏡，苯酚紅通透量，跨膜電阻以及堿性磷酸酶活性評(píng)價(jià)Caco-2細(xì)胞生長特性及用于藥物研究的可行性。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)室的Caco－2單層細(xì)胞培養(yǎng)物在培養(yǎng)條件下具有微絨毛，苯酚紅通透量<5%，跨膜電阻值>220Ω.cm2，堿性磷酸酶主要集中在絨毛膜面，與小腸類似，可以作為研究小腸藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的體外模型。
　　 2. 應(yīng)用Caco－2細(xì)胞模型研究藥用輔料PVPK30對(duì)更昔洛韋吸收的影響
　　 應(yīng)用Caco－

8、2細(xì)胞研究PVPK30的細(xì)胞毒性發(fā)現(xiàn)，濃度為30mg/ml以下的PVPK30未顯示細(xì)胞毒性，由此確定30、3、0.3mg/ml為跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)的高、中、低3種濃度。利用電阻儀測(cè)定電阻值和酚紅透過實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)其單層細(xì)胞的完整性。完整性檢測(cè)合格后即可用P-gp已知的底物維拉帕米[1]為陽性對(duì)照，塞利洛爾作為探針?biāo)幬?，利用HPLC法測(cè)定藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)量，結(jié)果表明PVPK30高濃度在Caco－2細(xì)胞模型中明顯抑制P－gp藥泵作用減少塞利洛爾從Caco-

9、2單層細(xì)胞膜BL側(cè)向AP側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)AP側(cè)向BL側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)，提高塞利洛爾的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，表明，PVPK30為有效的P－gp藥泵抑制劑。在此基礎(chǔ)之上，研究PVPK30對(duì)低生物利用度藥物更昔洛韋吸收的促進(jìn)作用?？缒まD(zhuǎn)運(yùn)2小時(shí)后PVPK30+更昔洛韋各濃度組BL側(cè)濃度分別為：1.7990，2.0023，2.0416 ug/ml均大于更昔洛韋單獨(dú)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)2小時(shí)后BL側(cè)濃度：1.4978 ug/ml，而陽性對(duì)照組更昔洛韋+維拉帕米2小時(shí)后BL側(cè)濃度為：

10、1.7392 ug/ml，同時(shí)發(fā)現(xiàn)PVPK30促進(jìn)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)具有一定濃度依賴性，SPSS軟件分析ratio值(BL→AP側(cè)Papp值與AP→BL側(cè)Papp值比值)結(jié)果表明：維拉帕米陽性對(duì)照組與陰性對(duì)照組之間有顯著性差異(P<0.05)，PVPK30低濃度組與陰性對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)，PVPK30中濃度組和PVPK30高濃度組與陰性對(duì)照組之間均有顯著性差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論：研究發(fā)現(xiàn)藥用輔料PVPK30可以