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文檔簡介
1、胃癌(gastric cancer, GC)是世界上癌癥致死的第二大因素,在中國GC患者的死亡數(shù)量占所有癌癥患者死亡數(shù)量的約23﹪。作為一種高度惡性的腫瘤,GC具有無限制性細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等特性。和其它惡性腫瘤一樣,GC的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程。首先,癌細(xì)胞無限制性生長;然后癌細(xì)胞自原發(fā)腫瘤脫落并侵襲至周圍組織或進(jìn)入血管和淋巴管;最終,癌細(xì)胞停留并定居在靶器官并形成轉(zhuǎn)移腫瘤。大多數(shù)的GC病人在確診時已進(jìn)入晚期,盡管放化療已用于治療
2、GC,但GC的預(yù)后仍不樂觀。
中藥取材方便、價廉、毒副作用小,故中藥及其有效成分抗腫瘤的機制研究已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點。柚皮素(naringenin,Nar),自柑橘類水果中提取,屬于二氫黃酮類化合物。它的生物活性廣泛,包括:抗癌基因活性、抗動脈粥樣硬化活性、抗炎作用、抗氧化作用等。和其它黃酮類化合物一樣,Nar可以通過一系列作用機制抑制癌細(xì)胞的生長,例如:破壞口腔鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞周期進(jìn)程,抑制人K562細(xì)胞白血病的細(xì)胞增殖
3、。另有報道顯示,Nar可以抑制癌細(xì)胞的遷移、轉(zhuǎn)移和組織侵襲。有研究證實,Nar對幾種典型的癌癥具有有效的抗癌作用,例如:膀胱癌、肝癌、乳腺癌和結(jié)腸癌。Nar的器官特異性癌癥化療作用和療效已被公認(rèn)并且Nar被認(rèn)為是癌癥的一種化療或治療藥物。而且,Nar對GC的初步抗癌活性也已被證實。近幾年的研究顯示Nar不僅可以抑制GC中的beta-catenin/Tcf信號通路,還可以上調(diào)GC誘導(dǎo)大鼠的氧化還原狀態(tài)從而降低患癌的風(fēng)險。然而,Nar對GC
4、發(fā)展轉(zhuǎn)移的影響及其作用機制仍有待闡明。
基于上述研究,為了進(jìn)一步了解Nar對GC是否具有治療作用,我們研究了:(1) Nar對人胃癌SGC7901細(xì)胞生長、增殖的影響。(2) Nar對人胃癌SGC7901細(xì)胞遷移和侵襲的影響。(3) Nar對人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡的影響。(4) Nar對人胃癌SGC7901細(xì)胞AKT信號通路的影響。最終闡明了Nar可以明顯抑制人胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這
5、些作用與AKT的磷酸化抑制和下游靶因子的表達(dá)有關(guān)。為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供實驗及理論依據(jù)。
第一部分 Nar對人胃癌SGC7901細(xì)胞生長、增殖的影響
目的:研究Nar對人胃癌SGC7901細(xì)胞生長、增殖的影響,明確Nar對人胃癌SGC7901細(xì)胞生長、增殖是否具有抑制作用。
方法:SGC7901細(xì)胞為人GC細(xì)胞,購買于上海生命科學(xué)細(xì)胞資源中心,并將細(xì)胞在RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基中含有:10
6、%胎牛血清、100 units/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素。培養(yǎng)箱的CO2濃度維持在5%,溫度維持在37℃。濃度為0.25%的胰酶(含有0.02% EDTA)用于細(xì)胞傳代,每周2~3次。
采用四甲基噻唑藍(lán)法(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)研究Nar對人胃癌SGC7901細(xì)胞生長率的影響。將SGC7901細(xì)胞以每孔1×104個細(xì)胞的密度接種在96孔板中并孵育24h,每種處理方式設(shè)6
7、個復(fù)孔。用不同濃度(0、5、10、20、40、80、160μmol/L)的Nar處理SGC7901細(xì)胞48h,另外用40μmol/L的Nar處理SGC7901細(xì)胞0、24、48和72h,觀察SGC7901細(xì)胞生長率的變化。
采用 Western-blot法檢測人胃癌 SGC7901細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白的表達(dá)變化。用濃度為0、20、40、80μm
8、ol/L的Nar處理SGC7901細(xì)胞48h后收集細(xì)胞,用于實驗。觀察人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖活性的變化。
結(jié)果:
1 MTT結(jié)果顯示:Nar濃度為5μmol/L時,SGC7901細(xì)胞的生長率沒有明顯的改變。但是,濃度為10、20、40、80和160μmol/L時,Nar對SGC7901細(xì)胞的生長率起劑量依賴性抑制作用(P<0.05);同時,Nar濃度為40μmol/L,分別處理SGC7901細(xì)胞0、24、48和
9、72h時,Nar對SGC7901細(xì)胞的生長率起時間依賴性抑制作用(P<0.05)。
2 Western-blot結(jié)果顯示:Nar濃度為0、20、40和80μmol/L時,Nar對SGC7901細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)起劑量依賴性抑制作用(P<0.05)。
結(jié)論:Nar呈劑量、時間依賴性的抑制人胃癌SGC7901細(xì)胞的生長、增殖。
第二部分 Nar對人胃癌SGC7901細(xì)胞遷移和侵襲的影響
目的:研究N
10、ar對人胃癌SGC7901細(xì)胞遷移和侵襲的影響,進(jìn)而探討Nar對人胃癌SGC7901細(xì)胞遷移和侵襲的作用及其可能的作用機制。
方法:細(xì)胞培養(yǎng)方法同第一部分。
細(xì)胞劃痕實驗用于檢測 Nar對人胃癌 SGC7901細(xì)胞遷移的影響。SGC7901細(xì)胞以每孔5×104個細(xì)胞的密度接種在12孔培養(yǎng)板內(nèi),生長至80~90%融合后用于實驗。用200μL槍頭將單層細(xì)胞劃痕后用PBS沖洗兩遍,然后用濃度為0、20、40、80μmol/
11、L的Nar處理SGC7901細(xì)胞48h,另外用40μmol/L的Nar處理SGC7901細(xì)胞24、48和72h,觀察SGC7901細(xì)胞遷移活性的變化。細(xì)胞遷移活性用遷移至劃痕處的細(xì)胞數(shù)量來表示。
Transwell小室法用于檢測Nar對人胃癌SGC7901細(xì)胞侵襲活性的影響。用濃度為0、20、40、80μmol/L的Nar處理SGC7901細(xì)胞48h,另外用40μmol/L的Nar處理SGC7901細(xì)胞24,48和72h,觀察
12、SGC7901細(xì)胞侵襲活性的變化。
實時定量RT-PCR和Western-blot用于檢測人胃癌SGC7901細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP2和MMP9)及其抑制劑(TIMP1和TIMP2)的mRNA和蛋白的表達(dá)變化。用濃度為0、20、40、80μmol/L的Nar處理SGC7901細(xì)胞48h后收集細(xì)胞,用于實驗。
結(jié)果:
1細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示:Nar濃度為0、20、40和80μmol/L時, Nar對 SG
13、C7901細(xì)胞的遷移活性起劑量依賴性抑制作用(P<0.05);同時,Nar濃度為40μmol/L,分別處理SGC7901細(xì)胞24,48和72h時, SGC7901細(xì)胞的遷移活性與對照組比較明顯下降(P<0.05)。
2 Transwell小室實驗結(jié)果顯示:Nar濃度為0、20、40和80μmol/L時, Nar對 SGC7901細(xì)胞的侵襲活性起劑量依賴性抑制作用(P<0.01);同時,Nar濃度為40μmol/L,分別處理SG
14、C7901細(xì)胞24、48和72h時, SGC7901細(xì)胞的遷移活性與對照組比較明顯下降(P<0.01)。
3實時定量RT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示:Nar濃度為0、20、40和80μmol/L時,Nar對SGC7901細(xì)胞MMP2和MMP9的mRNA和蛋白表達(dá)呈劑量依賴性抑制作用(P<0.05),但對TIMP1和TIMP2表達(dá)沒有明顯影響。
結(jié)論:Nar可以抑制人胃癌 SGC7901細(xì)胞的遷移和侵襲活
15、性,并且降低MMP2和MMP9的表達(dá)。表明Nar可能通過降低MMP2和MMP9的表達(dá)對人胃癌SGC7901細(xì)胞的遷移和侵襲發(fā)揮抑制性調(diào)節(jié)作用。
第三部分 Nar對人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡的影響
目的:研究Nar對人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡的影響,進(jìn)而探討Nar對人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡作用及其可能的作用機制。
方法:細(xì)胞培養(yǎng)方法同第一部分。
流式細(xì)胞術(shù)用于檢測人胃癌 SGC7901細(xì)胞的
16、凋亡率。用濃度為0、20、40和80μmol/L的Nar處理SGC7901細(xì)胞48h,另外用40μmol/L的Nar處理SGC7901細(xì)胞24、48和72 h后,用Annexin V-FITC孵育細(xì)胞,然后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。
實時定量RT-PCR和Western-blot用于檢測人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bax、Bcl-2、Survivin和Cleaved-Caspase-3的mRNA和蛋白的表達(dá)變化。用濃
17、度20、40和80μmol/L的Nar處理SGC7901細(xì)胞48h后收集細(xì)胞,用于實驗。
結(jié)果:
1流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:Nar濃度為0、20、40和80μmol/L時,Nar對SGC7901細(xì)胞的凋亡率起劑量依賴性促進(jìn)作用(P<0.05);同時,Nar濃度為40μmol/L,分別處理SGC7901細(xì)胞24、48和72h時,SGC7901細(xì)胞凋亡率與對照組比較明顯增加(P<0.05)。
2實時定量RT-PCR
18、和Western-blot結(jié)果顯示:Nar濃度為20、40和80μmol/L時,SGC7901細(xì)胞的促凋亡因子 Bax和 Cleaved-Caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05),而抑制凋亡的Bcl-2和Survivin的mRNA和蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)。
結(jié)論:Nar以劑量和時間依賴性促進(jìn)人胃癌 SGC7901細(xì)胞的凋亡。Nar通過增加 SGC7901細(xì)胞的促凋亡因子 Bax和 Cleaved
19、-Caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá),減少抑制凋亡因子Bcl-2和Survivin的mRNA和蛋白表達(dá)而起到促進(jìn)SGC7901細(xì)胞的凋亡作用。
第四部分 Nar對人胃癌SGC7901細(xì)胞AKT信號通路的影響
目的:研究Nar對人胃癌SGC7901細(xì)胞AKT信號通路的影響,進(jìn)而探討Nar是否通過下調(diào)AKT信號通路抑制人胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
方法:細(xì)胞培養(yǎng)方法同第一部分。
20、
首先,分別用濃度為0、20、40和80μmol/L的Nar對SGC7901細(xì)胞進(jìn)行處理,時間為24、48和72h;然后收集細(xì)胞進(jìn)行Western-blot檢測。檢測指標(biāo)為:AKT和p-AKT(磷酸化AKT)。
然后,將細(xì)胞分為四組:1組,不用任何試劑處理;2組,用濃度為50μmol/L的LY294002(AKT抑制劑)處理SGC7901細(xì)胞2h;3組,濃度為40μmol/L的Nar處理SGC7901細(xì)胞48h;4組
21、,首先用濃度為50μmol/L的LY294002處理SGC7901細(xì)胞2h,然后用濃度為40μmol/L的Nar處理SGC7901細(xì)胞48h。最后,用MTT檢測細(xì)胞的生長率;用劃痕實驗和 transwell小室檢測法檢測細(xì)胞的遷移和侵襲活性;用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡情況;用Western-blot檢測上述活性相關(guān)因子和AKT信號通路的蛋白表達(dá)情況,檢測指標(biāo)為:PCNA、Bax、Bcl-2、MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2、A
22、KT和p-AKT。
結(jié)果:
1 Nar對人胃癌SGC7901細(xì)胞AKT蛋白表達(dá)和磷酸化的影響。
Western-blot研究結(jié)果顯示:Nar以劑量和時間依賴方式抑制SGC7901細(xì)胞AKT的磷酸化,但AKT蛋白表達(dá)沒有明顯的變化。
2 Nar和AKT抑制劑LY294002對人胃癌SGC7901細(xì)胞生長的影響。
MTT研究結(jié)果顯示:Nar和LY294002均能降低SGC7901細(xì)胞的生長率
23、(P<0.01),并且兩種藥物共同作用于細(xì)胞時會進(jìn)一步降低SGC7901細(xì)胞的生長率(P<0.01)。
3 Nar和AKT抑制劑LY294002對人胃癌SGC7901細(xì)胞遷移和侵襲的影響。
細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示:Nar和LY294002均能降低SGC7901細(xì)胞的遷移活性( P<0.01),并且兩種藥物共同作用于細(xì)胞時會進(jìn)一步降低SGC7901細(xì)胞的遷移活性(P<0.01)。
Transwell小室實驗結(jié)果
24、顯示:Nar和 LY294002均能降低 SGC7901細(xì)胞的侵襲活性(P<0.01),并且兩種藥物共同作用于細(xì)胞時會進(jìn)一步降低SGC7901細(xì)胞的侵襲活性(P<0.01)。
4 Nar和AKT抑制劑LY294002對人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡的影響。
流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:Nar和LY294002均能促進(jìn)SGC7901細(xì)胞凋亡(P<0.01),并且兩種藥物共同作用于細(xì)胞時會進(jìn)一步促進(jìn) SGC7901細(xì)胞的凋亡(P<
25、0.01)。
5 Nar和AKT抑制劑LY294002對人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡相關(guān)因子及AKT蛋白表達(dá)和磷酸化的作用。
為了進(jìn)一步確認(rèn) Nar與 AKT抑制劑 LY294002聯(lián)合使用對人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及AKT蛋白表達(dá)和磷酸化的作用機制,采用Western-blot方法檢測了PCNA、Bax、Bcl-2、MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2、AKT和p-AK
26、T的表達(dá)變化。
Western-blot研究結(jié)果顯示:Nar和LY294002均能增加SGC7901細(xì)胞Bax的表達(dá)(P<0.05),并且兩種藥物共同作用于SGC7901細(xì)胞時會進(jìn)一步增加其表達(dá)(P<0.05,);Nar和LY294002均能降低SGC7901細(xì)胞PCNA、Bcl-2、MMP2、MMP9、p-AKT的表達(dá)(P<0.05),并且兩種藥物共同作用于細(xì)胞時會進(jìn)一步降低其的表達(dá)(P<0.05);但是,Nar和LY294
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