基于輔基法的多酶體系定向共固定化研究.pdf

1、隨著多酶級(jí)聯(lián)催化的廣泛應(yīng)用，多酶體系的共固定化也越來(lái)越受到關(guān)注。將多種酶在載體表面進(jìn)行級(jí)聯(lián)結(jié)合，充分地利用不同酶種的催化特性，提高中間產(chǎn)物的運(yùn)轉(zhuǎn)濃度，既能擴(kuò)展酶催化的應(yīng)用范圍，又可以提升多酶體系的整體反應(yīng)效率，在很大程度上克服了單酶反應(yīng)體系單一催化的局限性。而酶定向固定化是將酶蛋白有序地結(jié)合到載體的特定位點(diǎn)，能最大限度地保持酶的天然構(gòu)象，有助于保護(hù)酶催化的功能，具有非常重要的研究應(yīng)用價(jià)值。
　　葡萄糖氧化酶（Glucose oxi

2、dase，GOD）和膽固醇氧化酶（Cholesterol oxidase，ChOx），均以黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavine adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）為催化反應(yīng)活性中心。GOD和ChOx分別可以催化葡萄糖（Glucose）和膽固醇（Cholesterol）生成對(duì)應(yīng)產(chǎn)物和過(guò)氧化氫（H2O2）。H2O2不僅會(huì)對(duì)酶造成損傷，還作為中間產(chǎn)物發(fā)生累積從而抑制反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行。辣根過(guò)氧化物酶（Horseradish pero

3、xidase，HRP），以血紅素（Hemin）為活性中心，可消耗H2O2，促進(jìn)反應(yīng)正向進(jìn)行。因此GOD和ChOx可以與HRP分別構(gòu)建GOD-HRP以及ChOx-HRP多酶級(jí)聯(lián)催化體系。這三種氧化還原酶，均存在輔基—即活性中心，因此可借助輔基-脫輔酶親和作用構(gòu)建定向共固定化多酶體系。該方法能實(shí)現(xiàn)高度的定向化，且不涉及對(duì)酶分子的修飾改性，對(duì)酶損傷較小，具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　本文采用輔基定向固定化的方法制備多酶級(jí)聯(lián)催化體系：首先借助

4、導(dǎo)電聚合物—聚苯胺（Polyaniline，PANI）在氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）表面構(gòu)建了兩臂不對(duì)稱的“Y”型支架，分別將葡萄糖氧化酶（GOD）的輔基（黃素腺嘌呤二核苷酸，F(xiàn)AD）和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的輔基（血紅素，Hemin）固定在功能化的載體上，然后將脫輔基的酶與之重組，完成定向共固定化的GOD-HRP和ChOx-HRP多酶催化體系的構(gòu)建。
　　研究發(fā)現(xiàn)，GOD-HRP多酶催化體系電化學(xué)活性比GO

5、D單酶體系提高約3.6倍，底物反應(yīng)的線性范圍可達(dá)3~50mM；ChOx-HRP多酶催化體系電化學(xué)活性則比ChOx單酶體系提高約2.1倍，底物反應(yīng)的線性范圍可達(dá)3~80mM。定向共固定后的多酶體系熱穩(wěn)定性和耐酸堿性也有所增強(qiáng)。其中，GOD-HRP體系可在pH6.5~7.0保有較高的催化活力，最佳反應(yīng)溫度為35℃；ChOx-HRP體系適用于pH6.0~7.5環(huán)境，在35~45℃條件適用。
　　通過(guò)改變導(dǎo)電高分子的長(zhǎng)度，即調(diào)控多酶級(jí)聯(lián)催