人參皂苷CK對(duì)實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的治療作用及其抗炎免疫調(diào)節(jié)機(jī)制.pdf

1、前言
　　類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種自身免疫病。RA主要的病變位于關(guān)節(jié)滑膜,關(guān)節(jié)局部產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子和趨化因子使滑膜炎癥持續(xù)存在,滑膜增生,血管翳形成,侵蝕破壞軟骨和骨組織,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞和畸形。RA的發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚,目前認(rèn)為大量的活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞(dentritic cells,DC),相互活化,分泌細(xì)胞因子,是誘導(dǎo)RA自身免疫反應(yīng)發(fā)生,導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜炎癥

2、的關(guān)鍵因素。由于RA的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,目前還沒(méi)有滿意的治療方法。臨床上用于治療RA的藥物包括甾體抗炎藥、非甾體抗炎藥、疾病調(diào)修藥、生物制劑以及天然藥物等。近年來(lái),具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性的天然藥物及其有效成分,已經(jīng)成為治療RA新藥研發(fā)的熱點(diǎn)。人參皂苷CK(Ginsenoside Compound K,CK),屬于二醇型人參皂苷,為天然二醇型人參皂苷如人參皂苷Rb1、Rb2、Rc等在人腸道內(nèi)的主要降解產(chǎn)物,是人參皂苷在體內(nèi)吸收和發(fā)揮活性作

3、用的主要形式。文獻(xiàn)報(bào)道人參皂苷以及CK可抑制炎性細(xì)胞因子的分泌,提示CK具有一定的抗炎作用。然而CK對(duì)實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎是否具有治療作用,以及抗炎免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制不清楚。本研究觀察了CK對(duì)實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的治療作用,以及對(duì)免疫細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞)和成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast synoviocytes,FLS)的調(diào)節(jié)作用,明確CK對(duì)實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的治療作用,以及其發(fā)揮抗炎免疫調(diào)節(jié)作用的部分機(jī)制,為CK作為新型的治療R

4、A的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:觀察CK對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant-induced arthritis,AA)的治療作用,以及對(duì)免疫細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞)和滑膜細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用,明確CK對(duì)實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的治療作用及其發(fā)揮抗炎免疫調(diào)節(jié)作用的部分機(jī)制,為CK作為新型的治療RA的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:將10mg/ml弗氏完全佐劑(complete Freund adjuvant,CFA)充分混勻

5、,于每只大鼠右后足跖皮內(nèi)注射CFA0.1 ml,制備大鼠AA模型。正常組用生理鹽水同法注射。CK(5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg、160 mg/kg)每天一次灌胃給藥(intragastric administration,ig)(d15~d29),觀察大鼠全身關(guān)節(jié)炎評(píng)分,關(guān)節(jié)炎指數(shù),足爪腫脹數(shù)及足爪腫脹度;檢測(cè)脾臟和胸腺指數(shù),光學(xué)顯微鏡觀察踝關(guān)節(jié)和脾臟病理變化,并進(jìn)行病理評(píng)分;3

6、H-TdR檢測(cè)T、B細(xì)胞和滑膜細(xì)胞增殖;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟T細(xì)胞亞群包括初始T細(xì)胞亞群（CD4+CD62L+)、活化T細(xì)胞（CD4+CD25+)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Foxp3+,Treg);B細(xì)胞亞群包括記憶B細(xì)胞(CD45R+CD27+)和總B細(xì)胞（CD45R+IgM+)和T細(xì)胞上CD25的表達(dá)。ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necros

7、is factor,TNF-α)、γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、IL-4、IL-17、IL-10、IL-2、核因子κB受體活化因子配體(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B Ligand,RANKL)和骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)水平,以及血清IgG1、IgG2a、抗環(huán)瓜氨酸肽(cyclic cirullinated peptide,CCP)抗體和

8、抗II型膠原(CⅡ)抗體水平。DBA/1小鼠的尾根部皮內(nèi)注射CII乳劑誘導(dǎo)膠原性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis,CIA)模型,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴結(jié)樹(shù)突細(xì)胞(dedritic cells,DC)亞群包括單核細(xì)胞源性DC（monocyte-derived dedritic cells,mo-DC)(CD11b+CD209+)、漿細(xì)胞樣DC(plasmacytoid dendritic cells,pDC)(CD

9、11c+PDCA-1+)和初始T細(xì)胞亞群(CD4+CD62L+),以及DC上CD80、CD86、MHCⅡ、CCR7的表達(dá);ELISA檢測(cè)淋巴結(jié)CCL21水平;transwell檢測(cè)DC的遷移,混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)DC活化T細(xì)胞的能力。
　　結(jié)果:
　　1.CK可以減輕AA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀,改善脾臟和關(guān)節(jié)病理,抑制滑膜細(xì)胞異常增殖和分泌。
　　CK(10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg、

10、160 mg/kg)可以不同程度的減輕AA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀,包括降低關(guān)節(jié)炎全身評(píng)分和關(guān)節(jié)炎指數(shù),減少關(guān)節(jié)腫脹數(shù)和減輕關(guān)節(jié)腫脹度。隨劑量增加CK的抗炎作用逐漸增強(qiáng),當(dāng)劑量增加到160 mg/kg,其抗炎作用與80 mg/kg相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,已基本達(dá)到最大效能。CK的對(duì)數(shù)劑量與其全身評(píng)分的抑制率有明顯的線性關(guān)系(y=0.1606χ+0.1771,R2=0.8297,P=0.0116),CK的ED50值為102.5mg/kg。在抗炎作用起效

11、時(shí)間方面,CK(80mg/kg、160 mg/kg)d21開(kāi)始起效,CK(40 mg/kg)d24開(kāi)始起效,CK(10 mg/kg、20 mg/kg)d30開(kāi)始起效,隨著劑量的增大,起效時(shí)間逐漸提前。
　　CK(20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg、160 mg/kg)可以降低脾臟指數(shù),減輕AA大鼠的脾臟病理改變,包括降低動(dòng)脈周?chē)馨颓屎瓦吘墔^(qū)厚度、減輕淋巴小結(jié)增生和生發(fā)中心形成。CK(40 mg/kg、80 mg

12、/kg、160 mg/kg)可以改善AA大鼠的關(guān)節(jié)病理,包括抑制滑膜細(xì)胞增生和血管翳形成,減輕滑膜組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)以及骨破壞。CK(40 mg/kg、80 mg/kg、160 mg/kg)可以抑制滑膜細(xì)胞異常增殖,CK(1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L)體外給藥顯著恢復(fù)FLS分泌OPG,抑制RANKL的分泌。
　　2.CK可以減少T、B細(xì)胞活化,恢復(fù)細(xì)胞因子平衡。
　　CK(40 mg/kg、80 mg/k

13、g、160 mg/kg)可以降低AA大鼠脾臟中活化的T細(xì)胞的比例和記憶B細(xì)胞的比例,提高Treg和初始T細(xì)胞的比例,抑制T、B細(xì)胞的增殖。CK(10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg、160 mg/kg)可以降低血清抗II型膠原抗體,CK可以降低(160 mg/kg)IgG2a水平;對(duì)抗CCP抗體IgG1的水平?jīng)]有影響。CK(40 mg/kg、80 mg/kg、160 mg/kg)降低血清IL-1β水平,

14、對(duì)血清IL-4水平?jīng)]有影響。CK(20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg、160 mg/kg)可以抑制巨噬細(xì)胞IFN-γ的分泌,CK(40 mg/kg、80 mg/kg、160 mg/kg)可以抑制巨噬細(xì)胞IL-17的分泌,CK(80 mg/kg、160 mg/kg)可以抑制TNF-α的分泌,促進(jìn)IL-10的分泌。體外研究發(fā)現(xiàn)CK(10-5M,10-6M,10-7M)可以抑制AA大鼠T細(xì)胞的活化,表現(xiàn)為抑制其表面CD25的

15、表達(dá)以及IL-2的分泌。
　　3.CK可抑制樹(shù)突細(xì)胞成熟遷移和歸巢,減少T細(xì)胞的活化。
　　CK(56mg/kg、224mg/kg)可以減少CIA小鼠淋巴結(jié)mo-DC、pDC亞群的比例,增加初始T細(xì)胞比例,降低淋巴結(jié)CCL21水平。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CK(10-7M,10-5M)可以抑制DC上CCR7的表達(dá),抑制CCL21介導(dǎo)的DC的遷移;抑制DC的成熟,降低其表面共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ的表達(dá),減弱DC活化T細(xì)胞的