應(yīng)用亞低溫治療蛛網(wǎng)膜下腔出血導(dǎo)致的遲發(fā)血管痙攣的動物研究.pdf

1、目的：建立穩(wěn)定可靠的SAH動物模型，從腦血流的改變、腦底大血管的病理改變、神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及其相關(guān)基因的表達(dá)以及局部腦微環(huán)境生化代謝變化等方面，探討亞低溫對于蛛網(wǎng)膜下腔出血后遲發(fā)血管痙攣的腦組織的保護(hù)作用。 材料與方法： 1、選擇成年SD大鼠作為模型動物，采取改良的枕大池二次注血建立蛛網(wǎng)膜下腔出血模型。于二次注血后第5天進(jìn)行研究，亞低溫組用冰袋全身降溫治療另兩組維持體溫在正常范圍。 2、應(yīng)用激光多普勒(LDF)監(jiān)測

2、大鼠皮層腦血流的變化以及腦底大血管的病理改變證實血管痙攣的發(fā)生。 3、通過光鏡、電鏡研究對比腦底大血管的大體及超微結(jié)構(gòu)變化，來探求亞低溫對于遲發(fā)血管痙攣的治療作用。 4、采用原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法研究SAH大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)組織細(xì)胞凋亡情況、采用免疫組化方法研究該區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax的表達(dá)以及采用實時熒光定量PCR技術(shù)研究對皮層、腦干以及海馬三處腦神經(jīng)組織細(xì)胞凋亡調(diào)控基因ICE及Bcl-

3、XL mRNA 在腦神經(jīng)組織中表達(dá)變化，并初步探討SAH后亞低溫在減少遲發(fā)血管痙攣后細(xì)胞凋亡方面的治療作用。 5、利用微透析技術(shù)對SAH大鼠第五天進(jìn)行連續(xù)檢測8小時。檢測指標(biāo)為葡萄糖(Glu)、乳酸(Lac)、丙酮酸(Pyru)和乳酸/丙酮酸比值(L/P)。 結(jié)果： 1、本實驗大鼠的死亡率約為(10％)，蛛網(wǎng)膜下腔出血模型鼠血液主要分布于基底池、腳間池及額葉底面，亞甲藍(lán)與血液混合物主要沉積于顱底，同時在腦室及縱裂

4、池亦可見血液分布。假手術(shù)組大鼠注入人工腦脊液后未見發(fā)生顱內(nèi)出血及血液沉積現(xiàn)象。另外LDF 監(jiān)測結(jié)果以及大鼠基底動脈光電鏡的不同都證實動物模型制作成功。 2、對比皮層腦血流發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組有輕微腦血流變化。分析每小時的亞低溫組和對照組的腦血流都出現(xiàn)明顯下降趨勢，并且都與假手術(shù)組有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。而亞低溫組與對照組無明顯差異。 3、對比三組大鼠基底動脈光鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，另兩組均發(fā)生了明顯的血管痙攣，表現(xiàn)為血管直徑減

5、小、管壁增厚、管腔周長減少、內(nèi)彈力膜皺褶，同時可見痙攣血管細(xì)胞增殖現(xiàn)象明顯，但亞低溫組好于對照組。測量發(fā)現(xiàn)對照組基底動脈直徑減少了50.59％，管壁厚度增加了159.27％，管腔內(nèi)周長減少了62.50％。亞低溫組好于對照組，其中管壁厚度明顯低于對照組。(3)透射電子顯微鏡觀察：與假手術(shù)組比較，另兩組內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)類凋亡樣變化，包括內(nèi)皮細(xì)胞膜起泡，胞質(zhì)凝聚，胞漿空泡變，核染色質(zhì)凝聚、趨邊等現(xiàn)象，顯示基底動脈呈痙攣狀態(tài)。其中以對照組最顯著，伴

6、有大量內(nèi)皮細(xì)胞的剝離導(dǎo)致內(nèi)彈力膜的裸露，平滑肌細(xì)胞的壞死。亞低溫組未見細(xì)胞膜破裂，緊密連接尚好，內(nèi)彈力膜未見裸露，細(xì)胞連接未見明顯改變，胞質(zhì)中細(xì)胞器結(jié)構(gòu)尚清晰，可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基氏器、胞飲小泡、微絲及核糖體，細(xì)胞間連接未見明顯損傷，仍可見縫隙連接。 4、大鼠海馬CAl區(qū)HE染色發(fā)現(xiàn)對照組神經(jīng)細(xì)胞大部分細(xì)胞核濃縮、深染、溶解、消失，細(xì)胞間隙加大，神經(jīng)元密度均明顯減少。亞低溫組海馬CAl區(qū)部分神經(jīng)細(xì)胞，胞漿深染，細(xì)胞核固縮，存活神經(jīng)

7、元較對照組明顯增多；TUNEL 檢測發(fā)現(xiàn)對照組可見大量凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核固縮呈碎片狀，不規(guī)則，大小不一致，呈棕黃色顆粒。亞低溫也可見凋亡細(xì)胞，但是與對照組相比明顯減少且有統(tǒng)計學(xué)差異；亞低溫組Bcl-2免疫反應(yīng)強度高于對照組(P<0.05)及假手術(shù)組，而對照組Bax免疫反應(yīng)強度與假手術(shù)組相比明顯增強(p<0.01)。亞低溫組Bax免疫反應(yīng)強度雖升高，但其強度明顯低于對照組(p<0.05)；熒光定量PCR結(jié)果顯示：三組大鼠問的ICE在各腦區(qū)間

8、都有統(tǒng)計學(xué)差異，其值為：對照組>亞低溫組>假手術(shù)組。三組間的Bcl-XL在各腦區(qū)間都有統(tǒng)計學(xué)差異，在皮層、腦干中以亞低溫組最高，而假手術(shù)組最低；在海馬中對照組與假手術(shù)組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。 5、Glu和Pyru的變化：假手術(shù)組>亞低溫組>對照組；Lac變化：對照組>假手術(shù)組>亞低溫組；L/P變化：對照組>假手術(shù)組>亞低溫組。LSD比較以及重復(fù)測量結(jié)果均顯示，Lac、Pyru和L/P在假手術(shù)組和亞低溫組之間無統(tǒng)計學(xué)差異，而對照組與

9、另兩組差異顯著(p<0.05)。假手術(shù)組Glu與另兩組之間差異顯著(p<0.05)。亞低溫組與對照組無差異。 結(jié)論 1、通過對國內(nèi)外報道的枕大池二次注血模型的修改，我們認(rèn)為本實驗所使用動物模型可以作為對比亞低溫療效的可靠實驗平臺。 2、另外亞低溫治療并不會明顯降低血管痙攣期大鼠腦皮層的血流量。從而為發(fā)揮亞低溫降低腦代謝率、保護(hù)缺血腦組織的作用提供保證。 3、我們認(rèn)為亞低溫治療可能在一定程度上減輕或減緩血管