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文檔簡(jiǎn)介
1、惡性腫瘤發(fā)生過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一系列的細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)突變,導(dǎo)致癌基因的激活,抑癌基因的失活。大部分的惡性腫瘤細(xì)胞都擁有一些共同的特征,包括很強(qiáng)的增殖活性,組織侵襲性和轉(zhuǎn)移,細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)通路的失調(diào),持續(xù)的血管發(fā)生,抑制各種細(xì)胞死亡通路等等。近來(lái)研究表明,腫瘤細(xì)胞能夠通過(guò)一些特殊的機(jī)制逃避免疫系統(tǒng)的清除作用。CD47作為抗吞噬作用的信號(hào)分子,在腫瘤的免疫監(jiān)視中發(fā)揮著重要作用,腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)上調(diào)CD47的表達(dá)抑制吞噬作用。在對(duì)于白血病的研究中發(fā)現(xiàn)
2、,許多類(lèi)型白血病細(xì)胞及白血病干細(xì)胞的CD47表達(dá)都高于正常水平。CD47與巨噬細(xì)胞上受體信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)的相互作用傳遞抑制信號(hào),阻止腫瘤細(xì)胞被吞噬細(xì)胞清除。而采用抗CD47單克隆抗體阻斷這一信號(hào)通路后,能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的清除作用,具有治療意義。目前已在急性髄系白血病,非霍奇金淋巴瘤,急性淋巴細(xì)胞白血病中得到了驗(yàn)證,而CD47-SIRPα信號(hào)通路作用的深入分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
腫瘤細(xì)胞上的高表達(dá)的CD
3、47需要與巨噬細(xì)胞上受體SIRPα相結(jié)合才能發(fā)揮作用,我們通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)獲得包含結(jié)合位點(diǎn)的可溶性CD47胞外段蛋白,發(fā)揮“占位”作用,與腫瘤細(xì)胞表面的CD47競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合SIRPα,從而阻斷CD47-SIRPα信號(hào)通路,促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的清除作用。與CD47單克隆抗體有異曲同工之處。我們希望通過(guò)這一方法進(jìn)一步研究CD47在白血病治療中作用的深入分子機(jī)制,對(duì)于白血病及其他惡性腫瘤的靶向治療具有重要意義。
為此我們進(jìn)行了如下工
4、作:
1.原核表達(dá)可溶性CD47胞外段蛋白。用PCR技術(shù)以人淋巴結(jié)cDNA為模板擴(kuò)增出人CD47分子的胞外段,測(cè)序正確后將其插入原核表達(dá)載體pET32a(+)中,獲得表達(dá)載體pET32a-hCD47ext。之后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),優(yōu)化表達(dá)條件,使目的蛋白獲得最佳表達(dá),擴(kuò)大表達(dá)后用針對(duì)His標(biāo)簽的鎳金屬螯合柱純化,蛋白裂解后獲得純的TrxHis-hCD47ext蛋白。用SDS-PAGE及Wes
5、ternblot分析蛋白的表達(dá)情況及蛋白大小的正確性。
2.可溶性CD47胞外段蛋白TrxHis-hCD47ext與其受體SIRPα的結(jié)合。將我們表達(dá)的CD47胞外段蛋白添加到培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的上清中,用抗His的抗體通過(guò)流式細(xì)胞儀間接檢測(cè)結(jié)合后細(xì)胞表面熒光強(qiáng)度的變化,從而驗(yàn)證TrxHis-hCD47ext是否能夠與SIRPα相結(jié)合。
3.TrxHis-hCD47ext對(duì)人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat的作用。
6、為了驗(yàn)證可溶性的CD47胞外段蛋白是否能夠阻斷CD47-SIRPα信號(hào)通路,從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞的清除作用,我們采用Dio標(biāo)記的Jurkat細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的方法,將TrxHis-hCD47ext添加到共培養(yǎng)的上清中,用熒光顯微鏡觀察蛋白作用后巨噬細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞的吞噬作用的變化,同時(shí)驗(yàn)證TrxHis-hCD47ext的活性及功能。
結(jié)論:
1.實(shí)現(xiàn)了人CD47胞外段蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中的可溶性表達(dá),獲得
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