聯(lián)合激光捕獲顯微切割與二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜研究低惡性膀胱移行細(xì)胞癌蛋白表達(dá)譜和生物通路.pdf

1、目的：膀胱癌是我國最常見的泌尿腫瘤。近年來研究發(fā)現(xiàn)，膀胱移行細(xì)胞癌從生物學(xué)行為到病理形態(tài)可分成低惡性與高惡性膀胱移行細(xì)胞癌兩種類型(常被稱之為兩類癌)。兩類癌概念的提出為人們從分子與基因水平對膀胱移行細(xì)胞癌進(jìn)行分類與研究提供了新的視角，并為闡明其發(fā)病機制與指導(dǎo)治療，以及推測預(yù)后提供了更具科學(xué)性的依據(jù)，具有重要的理論與現(xiàn)實意義。因此，本研究即是在其指引下，尋找其差異表達(dá)蛋白，探究低惡性膀胱移行細(xì)胞癌的生物標(biāo)記以及發(fā)病機制，進(jìn)而揭示其發(fā)病規(guī)

2、律。同時，這也正是膀胱癌研究領(lǐng)域亟待解決的難題之一。 方法： 1．激光捕獲顯微切割獲得正常膀胱移行上皮細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞：采用Pix CellⅡLCM激光捕獲顯微切割設(shè)備獲得正常移行上皮以及腫瘤細(xì)胞各250，000shots，裂解后分別獲得 185.2μg、147.6μg總蛋白，為進(jìn)一步質(zhì)譜分析奠定基礎(chǔ)。 2．使用Finnigan線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀(LTQ)進(jìn)行液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜鑒定正常上皮以及腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)表

3、達(dá)譜，將實驗結(jié)果與目前已經(jīng)證實的膀胱癌及腫瘤差異表達(dá)蛋白進(jìn)行比較，同時選擇2個差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫蛋白印跡以及免疫組織化學(xué)驗證。 3．生物信息學(xué)工具分析鑒定的蛋白質(zhì)：使用蛋白質(zhì)分析工具鑒定蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)，包括總體平均親水性，跨膜區(qū)預(yù)測，分子量以及等電點。并初步對比正常上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)與腫瘤細(xì)胞表達(dá)蛋白的理化性質(zhì)。 4．以本表達(dá)譜中鑒定的蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)為蛋白質(zhì)生物標(biāo)記尋找進(jìn)行循證生物醫(yī)學(xué)探索，以期得到生物標(biāo)記蛋白基

4、本理化性質(zhì)的特點。 5．GO軟件分析腫瘤蛋白質(zhì)表達(dá)譜以及差異表達(dá)蛋白質(zhì)譜。GO分析的同時計算GO濃集/缺失表達(dá)，以了解腫瘤的細(xì)胞生理，并與尿液中蛋白質(zhì)的GO分析比對，探索尿液中侯選生物標(biāo)記蛋白的來源。 6．通路分析及可視化。將正常上皮細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞差異表達(dá)蛋白質(zhì)的IPI標(biāo)記號轉(zhuǎn)化為SWISSPORT-ACC-NUMBER，然后輸入ArrayTrack V.3.3.0 軟件包，對目前已知的生物通路進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，

5、檢索生物通路數(shù)據(jù)庫為KEGG。將差異表達(dá)蛋白質(zhì)的IPI標(biāo)記號轉(zhuǎn)化為Protein-RefSeQ，按照軟件要求的格式輸入GenMAPP軟件，實現(xiàn)生物通路的可視化。同樣的方法分析高惡性移行上皮癌的蛋白質(zhì)表達(dá)譜為進(jìn)一步分析兩類癌的不同分子機制奠定基礎(chǔ)。 結(jié)果： 1．蛋白質(zhì)表達(dá)譜結(jié)果：440個蛋白質(zhì)表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，其中24個假定蛋白，24個疏水性蛋白質(zhì)(5．5％)，TMHMM程序預(yù)測跨膜蛋白38個(8．6％)，84個(19．1％

6、)蛋白質(zhì)PI>9；76個(17．3％)蛋白質(zhì)分子量<10 kDa或者>100 kDa。 2．免疫蛋白印跡以及免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：NHERF在腫瘤組織中的表達(dá)明顯上調(diào) (P<0．05)，TPD52 在腫瘤組織中特異性表達(dá) (P<0．05)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：TPD52和NHERF 在膀胱癌中的表達(dá)陽性率明顯高于正常膀胱粘膜中的表達(dá)陽性率，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．01)。膀胱癌組織中TPD52 的陽性表達(dá)率隨著腫瘤病理分級

7、的升高而增加 (P<0．05)，而與腫瘤浸潤深度不具相關(guān)性(P>0．05)。NHERF 的表達(dá)與膀胱癌的病理分級、浸潤深度均不具相關(guān)性(P>0．05)。 3．循證生物醫(yī)學(xué)探索結(jié)果：129個蛋白質(zhì)被定義為生物標(biāo)記，其他蛋白為非生物標(biāo)記，這兩個蛋白組間PI，MW，GRAVY，跨膜區(qū)均沒有統(tǒng)計學(xué)差異。按照PI區(qū)分蛋白質(zhì)時，71個蛋白PI>9，317個蛋白PI≤9，這兩個組中分別有21和108個蛋白被定義為生物標(biāo)記，這兩個組之間的生物標(biāo)

8、記和非生物標(biāo)記的PI均數(shù)以及標(biāo)準(zhǔn)差之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。 4.GO分析結(jié)果：低惡性膀胱移行上皮癌中共鑒定440個蛋白質(zhì)。按人類 GO slimv1.8劃分440個蛋白質(zhì)中具有生物學(xué)途徑、細(xì)胞成分、分子功能注解的蛋白質(zhì)分別為312個(70.9％)、304個(69.1％)、346個(78.6％)。按照GO 4級分支術(shù)語生物學(xué)途徑、細(xì)胞成分、分子功能中濃集/缺失表達(dá)的蛋白分別為 41/22、25/11、23/20種。按人類GO slim

9、 v1.8 劃分差異表達(dá)蛋白質(zhì)中具有生物學(xué)途徑、細(xì)胞成分、分子功能注解的蛋白質(zhì)分別為267個(68.8％)、256個(66.0％)、297個(76.5％)。細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖、細(xì)胞循環(huán)、細(xì)胞分化、細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑中的蛋白質(zhì)分別為10、13、9、10、37個。 5.數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建：數(shù)據(jù)庫包括4個主要內(nèi)容：標(biāo)本信息、實驗過程、質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)、GO分析結(jié)果。質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)中包括蛋白質(zhì)名稱、蛋白質(zhì)描述、多個蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的登陸號、MW以及PI、

10、總體平均疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的交叉數(shù)據(jù)庫標(biāo)記號也包括在質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)中，包括IPI，Swiss-port，TrEMBL，RefSeQ，Ensembl和H-Inv等。質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)采用XML格式。GO分析結(jié)果采用表格形式來描述蛋白質(zhì)的生物學(xué)途徑、分子功能以及細(xì)胞組分。按照GO分支術(shù)語將蛋白質(zhì)聚類，儲存于同一數(shù)據(jù)層，同時包括蛋白質(zhì)的濃集/缺失表達(dá)分析。鑒定蛋白質(zhì)的IPI標(biāo)記號在數(shù)據(jù)庫中與GO分支術(shù)語直接關(guān)聯(lián)，因此擁有共同GO分支術(shù)語的蛋白列

11、表于同一數(shù)據(jù)層，GO分析中同時包含GO濃集/缺失表達(dá)分析。在數(shù)據(jù)庫中，用戶可以在GO等級術(shù)語蛋白質(zhì)列表中指定感興趣的蛋白質(zhì)，通過超鏈接可以獲得儲存于歐洲生物信息學(xué)研究所的GO術(shù)語信息以及蛋白質(zhì)信息。同時為了方便用戶查詢，數(shù)據(jù)庫中提供了簡單的根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)記號的查詢服務(wù)。數(shù)據(jù)庫儲存于 http：//www.Proteome-NHTE.org.cn，及http：//www.Proteome-SBTCC.org.cn。 6.生物通路分析

12、結(jié)果：ArrayTrack軟件分析差異表達(dá)蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示低惡性膀胱移行細(xì)胞癌中129個差異表達(dá)的蛋白定位于目前已知的生物通路，這些差異表達(dá)的基因主要屬于下列生物通路：氧化磷酸化、ECM受體相互作用、Toll-like受體通路、細(xì)胞通信、聚合黏附、核糖體、MAPK信號通路等。高惡性移行細(xì)胞癌中181個差異表達(dá)的蛋白定位于目前已知的生物通路，通路分析結(jié)果顯示，兩類癌中涉及的差異通路基本一致，但每個通路中發(fā)生改變的蛋白并不相同。結(jié)果提示腫瘤

13、發(fā)生發(fā)展過程中涉及多基因、多通路復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)異常；兩類癌存在不同的驅(qū)動機制。 結(jié)論： 1．本研究在國內(nèi)首次聯(lián)合應(yīng)用激光捕獲顯微切割與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建了膀胱癌差異表達(dá)蛋白譜。在低惡性膀胱移行細(xì)胞癌與相應(yīng)正常膀胱粘膜之間選出388個差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中包括305個特異表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，83個特異表達(dá)于正常上皮細(xì)胞，說明膀胱癌發(fā)生發(fā)展過程中存在多蛋白質(zhì)表達(dá)異常，這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)為膀胱癌分子機制研究提供了大量有價值的信息

14、。 2．在差異表達(dá)蛋白譜中挑取出2個差異蛋白TPD52，NHERF進(jìn)行經(jīng)典的免疫蛋白印跡檢測，結(jié)果顯示與正常膀胱粘膜比較，TPD52，NHERF 水平在低惡性膀胱移形細(xì)胞癌中差異表達(dá)，而且這兩個蛋白均通過一個肽段鑒定，證實了聯(lián)合激光捕獲顯微切割與串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行表達(dá)譜研究的可靠性。應(yīng)用免疫組化技術(shù)研究了TPD52 和 NHERF 在膀胱癌組織中的表達(dá)及臨床意義，結(jié)果顯示：TPD52和NHERF 在膀胱癌中表達(dá)陽性率明顯高于正常膀胱粘

15、膜中的表達(dá)陽性率，差異均有顯著意義(P<0．05)。膀胱癌組織中 TPD52的陽性表達(dá)隨著腫瘤病理分級的升高而增加(P<0．05)，而與浸潤深度無相關(guān)性(P>0．05)。NHERF的表達(dá)與浸潤深度、病理分級均不具相關(guān)性(P>0．05)。 3．循證分析的結(jié)果顯示：PI、MW 不能預(yù)測生物標(biāo)記，尚需要發(fā)展其他方法來指導(dǎo)2DE蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中對差異表達(dá)蛋白質(zhì)的選擇性切膠；Shotgun策略不但擴大了蛋白質(zhì)的檢出范圍，同樣擴大了生物標(biāo)記

16、的檢出；蛋白質(zhì)的基本理化描述，包括PI, MW，跨膜預(yù)測，GRAVY對生物標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)沒有預(yù)測意義；尚需要發(fā)展其他的生物信息學(xué)預(yù)測方法來預(yù)測為知蛋白成為生物標(biāo)記的可能性。 4．對腫瘤蛋白質(zhì)表達(dá)譜的GO濃集/缺失表達(dá)分析對深入了解低惡性淺表膀胱移行細(xì)胞癌的細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)生發(fā)展機制提供了理論依據(jù)，并根據(jù)PubMed文本信息挖掘揭示了傾向于在尿液中濃集表達(dá)的蛋白質(zhì)類別，為制備小型蛋白質(zhì)芯片從尿液中無創(chuàng)檢測腫瘤提供了理論依據(jù)，并進(jìn)一步證實

17、了本實驗結(jié)果的可靠性。 5．按照國際蛋白質(zhì)組學(xué)研究慣例，在蛋白質(zhì)鑒定信息以及功能分析的基礎(chǔ)上，建立了開放數(shù)據(jù)庫，為蛋白質(zhì)信息交流和比對提供了平臺。GO分支術(shù)語以及蛋白質(zhì)列表均與歐洲生物信息學(xué)中心建立超鏈接。用戶可以在任何等級指定GO術(shù)語，或者選定列表中的蛋白質(zhì)，通過超鏈接獲得儲存于OuickGO(http：//www.ebi.ac.uk/ego/)的GO數(shù)據(jù)或者存放于歐洲生物信息學(xué)研究所數(shù)據(jù)庫(http://www.ebi.ac