三氧化二砷對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-435s作用的初步研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見(jiàn)惡性腫瘤，全世界每年新發(fā)病例超過(guò)1，000，000例。在我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率逐年提高，且呈年輕化趨勢(shì)。乳腺癌已成為我國(guó)女性健康的重大威脅。三氧化二砷(arsenic trioxide，As<,2>O<,3>)是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，幾個(gè)世紀(jì)以前就被人們用來(lái)治療牛皮癬、風(fēng)濕癥、哮喘、梅毒、痔瘡等。自70年代初以來(lái)，As<,2>O<,3>被成功用于治療常規(guī)化療或維甲酸治療后復(fù)發(fā)的急性早幼粒白血病(acutepromyelocytic

2、 leukemia，APL)以后，砷劑成為國(guó)際血液、腫瘤學(xué)界研究的新熱點(diǎn)。近年來(lái)的研究證實(shí)，As<,2>O<,3>對(duì)APL以外的多種惡性血液病細(xì)胞和包括肝癌、腎癌、胰腺癌、食管癌、前列腺癌等在內(nèi)的多種實(shí)體瘤細(xì)胞均有明顯的抑制其生長(zhǎng)、誘導(dǎo)其凋亡的效果。但是As<,2>O<,3>用于乳腺癌的研究目前還較少。關(guān)于As<,2>O<,3>抗腫瘤的分子機(jī)制人們還不甚清楚，研究發(fā)現(xiàn)As<,2>O<,3>作用機(jī)制復(fù)雜，不同的濃度在不同的條件下，對(duì)于不同

3、的細(xì)胞種類作用途徑不同，因此探討其新的抗瘤譜及作用機(jī)制是十分必要的。 本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞培養(yǎng)的方法，觀察As<,2>O<,3>對(duì)人乳腺高轉(zhuǎn)移導(dǎo)管腺癌細(xì)胞系MDA-MB-435s的作用及對(duì)細(xì)胞bcl-2、bax表達(dá)的影響，初步探討了其可能的作用機(jī)制。為其進(jìn)一步應(yīng)用于該細(xì)胞的動(dòng)物研究及將來(lái)可能的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的： 觀察不同濃度As<,2>O<,3>對(duì)MDA-MB-435s細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用及誘導(dǎo)凋亡作用和對(duì)b

4、cl-2、bax表達(dá)的影響，初步探討了其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制。 方法： 應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，MTT法檢測(cè)As<,2>O<,3>對(duì)MDA-MB-435s細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化；應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳法和TUNEL法檢測(cè)凋亡；免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)觀察As<,2>O<,3>對(duì)MDA-MB-435s細(xì)胞內(nèi)bcl-2、bax表達(dá)的影響。統(tǒng)計(jì)分析：應(yīng)用SPSS11．0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素

5、方差分析，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果：@21．As<,2>O<,3>對(duì)MDA-MB-435s細(xì)胞體外生長(zhǎng)增殖抑制作用不同濃度As<,2>O<,3>均可抑制乳腺癌細(xì)胞株．MDA-MB-435s生長(zhǎng)，其抑制作用隨劑量增大而增強(qiáng)，呈劑量依賴性。0．5μmol/L組、1．0μmol/L組、1．5μmol/L組生長(zhǎng)抑制率無(wú)明顯差異(P＜0.05)，2．5μmol/L組與5．0μmol/L組生長(zhǎng)抑制率無(wú)明顯差異(P>0.05)，7．5μmol

6、/L與10.0μmol/L組生長(zhǎng)抑制率無(wú)明顯差異(P>0.05)，3個(gè)濃度梯度之間各劑量組兩兩比較生長(zhǎng)抑制率有明顯差異，P<0.05。 2．As<,2>O<,3>誘導(dǎo)MDA-MB-435s細(xì)胞凋亡的檢測(cè)1)ms<,2>O<,3>作用后MDA-MB-435s細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化倒置顯微鏡下觀察示：空白對(duì)照組MDA-MB-435s細(xì)胞呈梭形或細(xì)長(zhǎng)梭形，貼壁生長(zhǎng)，胞漿均勻透明，折光性好；1．5μmol/L組MDA-MB-435s細(xì)胞貼壁細(xì)胞

7、減少，出現(xiàn)脫落細(xì)胞，部分細(xì)胞失去正常形態(tài)，折光性減弱，胞內(nèi)出現(xiàn)不均勻顆粒；5．01μmol/L組MDA-MB-435s細(xì)胞貼壁細(xì)胞大量減少，脫落細(xì)胞增多，大部分細(xì)胞變圓變小，細(xì)胞胞體皺縮變形，胞內(nèi)顆粒增多，核染色質(zhì)固縮，聚集在核膜邊緣或近貼核膜，折光性差；10.0μmol/L組MDA-MB-435s成團(tuán)細(xì)胞相互分離，大部分細(xì)胞脫落，細(xì)胞胞體皺縮變形，核染色質(zhì)固縮，聚集在核膜邊緣或近貼核膜，或可見(jiàn)細(xì)胞碎片。 2)DNA瓊脂糖凝膠電

8、泳檢測(cè)細(xì)胞凋亡各劑量組比較：1．5μmol/L組未出現(xiàn)：DNA梯形凋亡條帶(DNA ladder)，2．5μmol/L組、5．0μmol/L組、7．5μmol/L組均出現(xiàn)明顯DNA梯形凋亡條帶，且隨As<,2>O<,3>濃度越大條帶越清晰。 3) TLYNEL，法檢測(cè)凋亡光學(xué)顯微鏡下觀察示：空白對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色染色；陰性對(duì)照組僅有個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)胞核棕黃色染色；1.5gμmol/L組部分細(xì)胞胞核中出現(xiàn)棕黃色染色區(qū)甚至棕黃

9、色濃染區(qū)；5.0gmol/L組大部分細(xì)胞胞核中出現(xiàn)棕黃色顆?；蚝酥馨朐滦巫攸S色濃染區(qū)；10.01amol/L組大部分細(xì)胞胞核中出現(xiàn)棕黃色濃染顆粒，可見(jiàn)有凋亡小體。 3．As<,2>O<,3>對(duì)MDA-MB-435s細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響bcl-2、bax陽(yáng)性表達(dá)均為棕褐色，位于胞漿。經(jīng)As<,2>O<,3>作用后與陰性對(duì)照組比較bcl．2表達(dá)降低，bax表達(dá)升高。應(yīng)用陽(yáng)性區(qū)平均灰度值進(jìn)行比較，bcl-2各用藥組與陰性對(duì)照組比較均具有

10、顯著性差異(P<0.05)；用藥組間兩兩比較，各用藥組間亦存在顯著性差異(P<0.05)。bax各用藥組與陰性對(duì)照組存在顯著性差異(P<0.05)；各用藥組問(wèn)比較亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論： 1．As<,2>O<,3>對(duì)MDA-MB-435s細(xì)胞有顯著的體外生長(zhǎng)抑制作用，其抑制作用隨劑量增大而增強(qiáng)，呈劑量依賴性。 2．As<,2>O<,3>在體外能誘導(dǎo)MDA-MB-435s細(xì)胞凋亡，凋亡效應(yīng)與劑量呈