新基因URG4在肝癌組織中的表達及其對肝癌細胞生長的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、【背景】
  肝細胞肝癌(HCC,以下簡稱肝癌)是我國常見的惡性腫瘤之一,嚴重危害國人的健康。我國肝癌的主要病因為乙型肝炎病毒(HBV)的長期慢性感染,并且HBVX開放讀框編碼的乙肝病毒X蛋白(HBx)在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。HBx具有轉錄激活子功能,調節(jié)細胞中許多與細胞凋亡和周期相關的基因的表達;HBx能調節(jié)胞漿中的多種信號轉導途徑;HBx能影響DNA修復。但上述這些機制只能部分解釋HBx在HBV誘導肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用

2、。HBx發(fā)揮作用的機制還存在許多不明之處。為了進一步尋找HBx發(fā)揮作用的其它分子,我們課題組運用抑制消減雜交及全長PCR擴增技術(RACE-PCR)克隆出了一個可以被HBx蛋白上調新基因URG4(Upregulatedgene4),該基因全長3607bp,編碼104KD的蛋白。經(jīng)NIH人類基因組數(shù)據(jù)庫比較,此基因定位在人類7號染色體,無同源基因。蛋白質綜合信息庫分析(SWISSPROT),此蛋白具有一個穿膜螺旋(Transmembran

3、e helices:336-353);三個核內信號定位肽(Nuclear localization signals:PYRGKRN380、PRPRDKR821、PRDKRQL823);一個ATP/GTP結合區(qū)(ATP/GTP binding site690-697 GVPGTGKS),與caspase修復成員6(caspase recruitment domain family6)在88-461氨基酸之間有34%同源。初步研究發(fā)現(xiàn)此基因

4、不僅可以促進腫瘤細胞生長,還可促進腫瘤細胞在體內的成瘤性,為又一新的促癌基因。但其發(fā)揮作用的分子機制還不清楚。
  【目的】
  1、檢測URG4在肝癌組織及肝癌細胞系中的表達及意義。
  2、探討URG4與HBx在肝癌組織及細胞中表達之間的關系。
  3、檢測URG4對肝癌細胞生長的影響及相關機制。
  【方法】
  1、免疫組化方法檢測URG4和HBx在正常組織、肝癌組織及癌旁組織中的表達分布,并

5、分析其表達的意義及表達之間的相關性。
  2、RT-PCR和Westernblot檢測肝癌細胞系(HHCC、HepG2和SMMC-7721)、永生化肝細胞QZG及轉染HBx基因的肝癌細胞中URG4的mRNA及蛋白的表達。
  3、脂質體法將URG4基因的真核表達載體轉入QZG細胞,將URG4特異SiRNA載體轉染入肝癌HepG2細胞中,G418篩選穩(wěn)定表達的單集落。
  4、MTT法繪制轉染細胞及其對照細胞的生長曲線。

6、
  5、流式細胞儀分析轉染細胞及其對照細胞的細胞周期分布。
  6、平板集落形成實驗檢測轉染細胞及對照細胞的集落形成能力。
  7、軟瓊脂集落形成實驗檢測URG4表達抑制后,肝癌細胞的體外成瘤能力的變化。
  8、Westernblot和RT-PCR檢測轉染細胞和對照細胞周期相關分子cyclinD1的變化。
  【結果】
  1、URG4在肝癌組織、癌旁組織和正常組織中的表達
  100例肝癌

7、標本中,48例URG4陽性表達,陽性表達率為48%;癌旁組織中URG4陽性表達54例(54%),并且URG4主要表達在肝硬化組織中;在27例正常組織中,僅6例弱表達URG4,陽性率22.2%。同時在肝癌細胞系HHCC、HepG2和SMMC-7721中可檢測到不同程度的URG4mRNA及蛋白的表達,以HepG2細胞中表達最高,但在永生化肝細胞QZG中沒有檢測到URG4的表達。URG4在肝癌和癌旁肝硬化組織中的表達高于正常組織,在肝癌細胞系

8、中的表達也高于永生化細胞。
  2、HBx在肝癌組織和癌旁組織中的表達及其與URG4表達的關系
  肝癌細胞中HBx幾乎全部表達于細胞質中,偶見部分核染色。78例乙肝相關性肝癌標本中,60例HBx陽性表達,陽性表達率為76.9%;癌旁組織中HBx陽性表達65例(83.3%),并且HBx也主要表達在肝硬化組織中;在27例正常組織中,沒有檢測到HBx的表達。相關性分析發(fā)現(xiàn)肝癌組織中HBx和URG4表達的相關系數(shù)0.38(P<0.

9、05),并且在肝癌癌旁組織中的相關系數(shù)0.45(P<0.05)。HBx基因穩(wěn)定轉染的HepG2細胞中,URG4mRNA和蛋白表達水平均上調。
  3、URG4對肝癌細胞生長的影響
  將URG4正義載體轉染入QZG細胞后,發(fā)現(xiàn)QZG細胞生長加快,由G1期進入S期的細胞比例增加;將URG4-siRNA轉染入肝癌細胞HepG2后,HepG2細胞的生長顯著減慢,錨定非依賴性生長的能力、單細胞集落形成能力以及裸鼠體內成瘤能力均顯著減

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