mCD99L2基因靶向siRNA誘導(dǎo)小鼠A20細(xì)胞轉(zhuǎn)化為H-RS樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景 淋巴瘤是原發(fā)于淋巴造血組織的免疫系統(tǒng)惡性腫瘤，隨著AIDS、器官移植、腫瘤放化療免疫抑制的應(yīng)用等近年來發(fā)病率急劇升高。引人關(guān)注的是霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma，HL)獨(dú)特的組織病理學(xué)特征，它雖是惡性淋巴瘤，但與非霍奇金淋巴瘤(nonHodgkin'slymphoma，NHL)卻截然不同：(1)HE的惡性細(xì)胞成分H/RS細(xì)胞一般只占腫瘤組織的極少部分(＜1％)，其余是大量以淋巴細(xì)胞為主的背景細(xì)胞；(2)隨

2、著病變發(fā)展H/RS細(xì)胞的數(shù)量增加，而背景細(xì)胞數(shù)目減少；(3)H/RS細(xì)胞不但在原發(fā)灶內(nèi)與背景細(xì)胞同時(shí)存在，而且在擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的病灶內(nèi)也同時(shí)出現(xiàn)；(4)患者的預(yù)后與H/RS細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，而與背景細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，極少量的H/RS細(xì)胞卻直接影響著HL的惡性程度與預(yù)后。令人費(fèi)解的是如此少量的H/RS細(xì)胞是如何生存于大量背景細(xì)胞之中?它與背景細(xì)胞之間究竟存在怎樣復(fù)雜的相互關(guān)系?它雖然失去表達(dá)免疫球蛋白的能力，但卻能逃避凋亡而持續(xù)增生；H/RS細(xì)

3、胞是如何發(fā)生、發(fā)展而來的?要 人CD99(mic2)是一種32kD細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，編碼基因位于X和Y染色體短臂假染色體區(qū)(PAR)的Xp22.32-pter和Yp11-pter上，連鎖分析提示PAR是HL的潛在致瘤基因，參與血細(xì)胞的分化等。Y.H.Suh(2003)首先報(bào)道了與人CD99同源的小鼠CD99基因——mCD99L2(MouseCD99antigen-like2)。 目的 1.明確cHL中H/RS細(xì)

4、胞mic2/CD99表達(dá)與Eber-1/LMP-1表達(dá)的相互關(guān)系。 2.檢測(cè)小鼠A20細(xì)胞株mCD99L2基因及構(gòu)建siRNA慢病毒表達(dá)載體。 3.沉默A20細(xì)胞的mCD99L2基因，誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為H/RS樣細(xì)胞，構(gòu)建mCD99L2低表達(dá)的A20RSL(CD99L2-A20H/RS-likecell)細(xì)胞模型。 4.構(gòu)建小鼠H/RS樣細(xì)胞荷瘤裸鼠模型、荷瘤BALB/c小鼠模型。 方法 1.采用分子原

5、位雜交和免疫組化技術(shù)并結(jié)合組織芯片技術(shù)檢測(cè)59例石蠟包埋淋巴瘤組織標(biāo)本[43例cHL，16例非霍奇金淋巴瘤(NHL)]mic2/CD99和Eber-1/LMP-1的表達(dá)，比較分析mic2/CD99在兩組中的表達(dá)及與Eber-1/LMP-1的關(guān)系。 2.設(shè)計(jì)mCD99L2基因寡核苷酸探針和特異性PCR引物，采用分子原位雜交、RT-PCR方法和T-A克隆技術(shù)檢測(cè)A20細(xì)胞中mCD99L2基因的mRNA表達(dá)。 3.運(yùn)用RNAi

6、技術(shù)構(gòu)建入門載體PE-mCD99L2及siRNA慢病毒表達(dá)載體LV-mCD99L2，靶向沉默A20細(xì)胞mCD99L2基因，經(jīng)過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和殺稻瘟菌素篩選克隆，用軟瓊脂克隆形成法和96孔板有限稀釋法篩選A20-LV-mCD99L2單克隆。 4.應(yīng)用PI染色、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和分析siRNA慢病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染率。 5.采用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)A20-LV-mCD99L2克隆株基因組與LV-mCD99L2載體整合情況；RT-P

7、CR、FQ-RT-PCR檢測(cè)mCD99L2基因靶向RNAi的效率；在光鏡、透射電鏡、掃描電鏡下觀察A20-LV-mCD99L2單克隆的細(xì)胞形態(tài)特征；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A20-LV-mCD99L2克隆株的細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡情況；MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；光鏡下測(cè)試網(wǎng)格計(jì)數(shù)法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)由A20-LV-mCD99L2克隆株轉(zhuǎn)化為CD99L2-A20RSL細(xì)胞(直徑~25μm)的轉(zhuǎn)化率；Transwell檢測(cè)A20-LV-mCD99L2克隆株的微侵襲

8、能力；mCD99L2基因寡核苷酸探針原位雜交檢測(cè)A20-LV-mCD99L2克隆株和CD99L2-A20RSL細(xì)胞的mCD99L2基因mRNA表達(dá)；免疫熒光標(biāo)記CD15、CD30檢測(cè)A20-LV-mCD99L2克隆株和CD99L2-A20RSL細(xì)胞的表達(dá)。 6.將A20-LV-mCD99L2克隆株移植到裸鼠皮下成瘤，并將體內(nèi)成瘤的瘤組織塊和原代細(xì)胞接種到下一代裸鼠，在裸鼠體內(nèi)傳3代，每一代瘤組織均作原代培養(yǎng)并做上述檢測(cè)和鑒定，建

9、立A20-LV-mCD99L2克隆株裸鼠皮下荷瘤模型。 7.分別將第一代和第二代裸鼠體內(nèi)成瘤的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的瘤組織塊和原代細(xì)胞株移植到BALB/c小鼠皮下成瘤，并將成瘤的瘤組織塊和原代培養(yǎng)細(xì)胞做上述檢測(cè)和鑒定。 結(jié)果 1.cHL中H/RS細(xì)胞mic2基因/CD99蛋白表達(dá)cHL組CD99蛋白表達(dá)陽性率為2.3％，mic2基因表達(dá)為55.8％，LMP1表達(dá)為58.1％，Eber-1表達(dá)為53.5％；NHL組CD9

10、9蛋白與mic2基因表達(dá)高于cHL組(P＜0.05)；LMP1和Eber-1的表達(dá)低于cHL組(P＜0.05)；mic2基因的表達(dá)高于CD99蛋白的表達(dá)(P＜0.05)；Eber-1與LMP1的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。CD99蛋白與LMP1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)各項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)與性別無關(guān)。CD99蛋白與LMP1的表達(dá)與年齡呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，mic2與Eber-1的表達(dá)與年齡無關(guān)(P＞0.05)。 2.A2

11、0細(xì)胞中mCD99L2基因檢測(cè)及克隆 原位雜交方法檢測(cè)A20細(xì)胞中mCD99L2基因mRNA呈陽性表達(dá)；RT-PCR法獲得mCD99L2基因cDNA序列，用T-A克隆技術(shù)獲得mCD99L2基因克隆。DNA測(cè)序的結(jié)果與GenBank提供的已知序列(NM-138309)完全一致。 3.A20細(xì)胞mCD99L2基因靶向RNAi及CD99L2-A20RSL細(xì)胞模型的建立 4.皮下移植A20-LV-mCD99L2克隆株荷瘤

12、裸鼠模型的建立 A20-LV-mCD99L2克隆株首代皮下移植裸鼠10只(30個(gè)位點(diǎn))，移植成功率63.3％，而第3代移植裸鼠8只(8個(gè)位點(diǎn))移植成功率100％。A20-LV-mCD99L2克隆株在裸鼠體內(nèi)傳至第3代，共皮下移植裸鼠26只，平均潛伏期為7d，傳代間期為20d。實(shí)驗(yàn)組A20-LV-mCD99L2細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤，光鏡下見腫瘤細(xì)胞大小不一，彌漫分布，核大深染，核圓形、卵圓形或不規(guī)則形，病理核分裂像多見；可見散在胞質(zhì)

13、豐富的大細(xì)胞呈雙核、多核，核仁大、微嗜酸性，呈典型的H/RS樣細(xì)胞形態(tài)。檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與細(xì)胞基因組整合情況，電泳可見基因片段282bp，證實(shí)瘤體細(xì)胞攜帶質(zhì)粒DNA，并整合到基因組。荷瘤組織原位雜交檢測(cè)CD99L2-A20RSL細(xì)胞mCD99L2基因mRNA的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞比對(duì)照組A20細(xì)胞明顯減弱。荷瘤組織冰凍切片，CD30免疫熒光標(biāo)記，結(jié)果與細(xì)胞模型一致。 5.皮下移植A20-LV-mCD99L2A1、A2細(xì)胞荷瘤B

14、ALB/c小鼠模型的建立 A20-LV-mCD99L2A1、A2瘤組織塊和原代細(xì)胞分別皮下移植BALB/c小鼠6只(6個(gè)位點(diǎn))，平均潛伏期為6d。實(shí)驗(yàn)組成瘤率為33％。檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與細(xì)胞基因組整合情況，電泳可見基因片段282bp，證實(shí)瘤體細(xì)胞攜帶質(zhì)粒DNA，并整合到基因組。光鏡下見腫瘤細(xì)胞大小不一，彌漫分布，可見散在分布的胞質(zhì)豐富的大細(xì)胞呈雙核、多核，核仁大，呈典型的H/RS樣細(xì)胞形態(tài)；在腫瘤細(xì)胞周圍可見淋巴細(xì)胞、漿細(xì)

15、胞、嗜酸細(xì)胞和組織細(xì)胞等背景細(xì)胞，出現(xiàn)了類似人cHL的組織病理表現(xiàn)。 結(jié)論 1.cHL中H/RS細(xì)胞CD99蛋白表達(dá)與LMP1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，CD99蛋白在H/RS細(xì)胞中低表達(dá)，可能是H/RS細(xì)胞表型變化特點(diǎn)之一，具有臨床病理診斷和鑒別診斷意義。 2.小鼠A20細(xì)胞具有mCD99L2基因的mRNA表達(dá)，沉默目的基因mCD99L2的siRNA靶序列(nt205-nt223)，能誘導(dǎo)A20細(xì)胞轉(zhuǎn)化為H/RS樣細(xì)胞

16、，即CD99L2-A20RSL細(xì)胞。mCD99L2可能是A20細(xì)胞轉(zhuǎn)化為H/RS樣細(xì)胞的關(guān)鍵基因。 3.將A20-LV-mCD99L2克隆株皮下移植裸鼠和BALB/c小鼠，可獲得荷瘤裸鼠模型和荷瘤BALB/c小鼠模型，后者出現(xiàn)了背景細(xì)胞，類似人cHL的病理形態(tài)特征。 創(chuàng)新之處 1.應(yīng)用組織芯片技術(shù)、原位雜交和免疫組化技術(shù)同步檢測(cè)cHL石蠟標(biāo)本中mic2/CD99、Eber-1/LMP-1的表達(dá)，證實(shí)cHL中H/R

17、S細(xì)胞CD99蛋白表達(dá)與LMP1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，明確了cHL中H/RS細(xì)胞mic2基因mRNA與CD99蛋白表達(dá)的不一致性，提出CD99蛋白在H/RS細(xì)胞中低表達(dá)，可能是H/RS細(xì)胞表型變化的特點(diǎn)。 2.運(yùn)用原位分子雜交和RT-PCR的方法證實(shí)了A20細(xì)胞具有mCD99L2基因。 3.運(yùn)用RNAi技術(shù)靶向沉默A20細(xì)胞mCD99L2基因，誘導(dǎo)A20細(xì)胞轉(zhuǎn)化為H/RS樣細(xì)胞，初步建立了小鼠H/RS樣細(xì)胞模型，命名為CD