stathmin參與調(diào)控H-RS細(xì)胞向B細(xì)胞分化機(jī)制的初步研究.pdf

1、研究背景:
　　 霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma，HL)是一種淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，其中經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤(classicHodgkinlymphoma,cHL)約占霍奇金淋巴瘤病例的95％。該疾病為單克隆性淋巴細(xì)胞腫瘤，病變的典型形態(tài)特點是由少數(shù)的單核的霍奇金（Hodgkin）細(xì)胞和多核的Reed-Stemberg(RS)細(xì)胞組成H/RS細(xì)胞，背景中有數(shù)量不等的非腫瘤性背景細(xì)胞。約98％以上的H/RS細(xì)胞起源于

2、生發(fā)中心階段分化的成熟B細(xì)胞，極少數(shù)起源于外周T細(xì)胞。
　　 本課題組在探究CD99+/mCD99L2-調(diào)控B淋巴瘤細(xì)胞與H/RS細(xì)胞轉(zhuǎn)化靶蛋白及信號通路的研究中，前期構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)CD99基因的cHL（B細(xì)胞來源）L428細(xì)胞株---L428-CD99細(xì)胞亞系和穩(wěn)定敲低CD99基因的鼠B細(xì)胞來源淋巴瘤A20細(xì)胞株---LV-mCD99L2-A20亞系，將L428、L428-CD99細(xì)胞及A20、LV-mCD99L2-A20細(xì)胞

3、分別進(jìn)行雙向凝膠電泳實驗，經(jīng)生物信息學(xué)分析比對，從差異蛋白中挑選出stathmin蛋白作為研究對象。
　　 stathmin蛋白是一種廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)中高度保守的磷酸化蛋白，屬于微管調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白，能通過調(diào)節(jié)微管解聚，參與微管的組裝，調(diào)節(jié)微管動態(tài)平衡;還能與多種蛋白相結(jié)合，參與細(xì)胞周期、增殖、運動等許多細(xì)胞內(nèi)生物進(jìn)程;與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)。
　　 值得注意的是，近年來研究發(fā)現(xiàn)stathmin在細(xì)胞分

4、化過程中起了十分重要的作用。有文獻(xiàn)表明，在正常淋巴造血系統(tǒng)中，stathmin參與T淋巴細(xì)胞在胸腺組織的成熟過程;stathmin表達(dá)的下降促使巨核細(xì)胞分化成熟及血小板的形成。在淋巴造血系統(tǒng)腫瘤中，Stathmin蛋白表達(dá)對于維持和轉(zhuǎn)變白血病細(xì)胞表達(dá)至關(guān)重要。然而，stathmin是否參與B細(xì)胞分化過程，在B細(xì)胞分化過程中呈現(xiàn)怎樣的趨勢，未見報道。
　　 為此，本研究采用免疫組織和細(xì)胞化學(xué)、實時熒光定量RT-PCR、Wester

5、nblot、免疫熒光共聚焦顯微鏡檢測等方法，觀測stathmin在病理組織和淋巴瘤細(xì)胞中的表達(dá)與定位;干擾stathmin基因后檢測漿細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PRDM1的表達(dá)、漿細(xì)胞免疫表型的表達(dá)及細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，明確stathmin是否參與H/RS細(xì)胞向末端B細(xì)胞方向分化;調(diào)控與cHL最密切相關(guān)的NF-kappaB通路，探究NF-kappaB通路、stathmin、PRDM1的調(diào)控關(guān)系及誘導(dǎo)分化可能性，為進(jìn)一步闡述H/RS細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)

6、展、轉(zhuǎn)化與分化機(jī)制提供參考依據(jù)。
　　 研究目的：
　　 本研究擬通過四部分進(jìn)行:
　　 一、Stathmin在B淋巴瘤組織和細(xì)胞株的表達(dá)
　　 收集不同分化階段的B細(xì)胞淋巴瘤組織和細(xì)胞株，檢測stathmin的表達(dá)，探究stathmin在B細(xì)胞分化階段的表達(dá)規(guī)律。
　　 二、Stathmin在cHL細(xì)胞株L428和L428-CD99細(xì)胞表達(dá)與定位
　　 檢測cHL細(xì)胞株L428及L428

7、-CD99亞系stathmin的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位。
　　 三、調(diào)節(jié)stathmin促進(jìn)H/RS細(xì)胞向末端B細(xì)胞方向分化
　　 探究stathmin與B細(xì)胞分化的關(guān)系，明確L428和L428-CD99細(xì)胞下調(diào)stathmin基因?qū){細(xì)胞分化調(diào)控因子PRDM1的調(diào)控關(guān)系、分化相關(guān)抗原的改變和對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，揭示stathmin基因在cHL分化所扮演的角色。
　　 四、NF-κB信號通路調(diào)控stathmin影響

8、H/RS細(xì)胞向末端B細(xì)胞方向分化
　　 通過激活和抑制NF-κB信號通路，探究stathmin是否通過NF-κB信號通路參與H/RS細(xì)胞向末端B細(xì)胞方向分化。
　　 研究內(nèi)容與方法：
　　 一、Stathmin在B淋巴瘤組織和細(xì)胞株的表達(dá)
　　 收集反應(yīng)性淋巴結(jié)增生（reactivelymphoidhyperplasia，RH）、cHL、生發(fā)中心樣(germinalcenterBcell-like，GCB

9、)和活化B細(xì)胞樣(activatedBcell-like，ABC)型彌漫大B淋巴瘤（DiffuselargeBcelllymphoma，DLBCL）、漿細(xì)胞性骨髓瘤(plasmacellmyeloma，PCM)組織標(biāo)本，通過免疫組化檢測組織中stathmin表達(dá);進(jìn)一步利用Westernblot檢測不同分化階段B淋巴瘤細(xì)胞株stathmin的表達(dá)。
　　 二、Stathmin在cHL細(xì)胞株L428和L428-CD99細(xì)胞表達(dá)與定

10、位
　　 利用westernblot、免疫熒光共聚焦顯微鏡檢測L428及L428-CD99細(xì)胞中stathmin與acetylationα-tubulin的表達(dá)和共定位;利用免疫熒光共聚焦顯微鏡、實時熒光定量RT-PCR、westernblot、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測L428及L428-CD99細(xì)胞中stathmin和PRDM1的表達(dá)。
　　 三、調(diào)節(jié)stathmin促進(jìn)H/RS細(xì)胞向末端B細(xì)胞方向分化
　　 1.L4

11、28和L428-CD99細(xì)胞瞬時干擾stathmin基因?qū)細(xì)胞分化的影響
　　 L428和L428-CD99細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染stathmin小分子干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，利用實時熒光定量RT-PCR、Westernblot檢測stathmin的干擾效率及PRDM1表達(dá)差異;利用流式細(xì)胞儀檢測L428細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染干擾stathmin基因后相關(guān)分化抗原表達(dá)。
　　 2.L428細(xì)胞瞬時

12、干擾stathmin基因?qū)ι飳W(xué)特性的影響
　　 利用CCK8實驗、流式細(xì)胞儀檢測，探究干擾stathmin基因?qū)428細(xì)胞增殖能力、凋亡和周期的影響。
　　 四、NF-κB信號通路調(diào)控stathmin影響H/RS細(xì)胞向末端B細(xì)胞方向分化
　　 1.調(diào)控NF-κB信號通路對B細(xì)胞分化的影響
　　 通過對L428細(xì)胞添加NF-κB信號通路抑制劑和L428-CD99細(xì)胞添加激活劑，利用實時熒光定量RT-PC

13、R、Westernblot檢測stathmin及PRDM1表達(dá);利用流式細(xì)胞儀檢測抑制NF-κB信號通路活性后L428細(xì)胞相關(guān)分化抗原的表達(dá)。
　　 2.抑制NF-κB信號通路活性對L428細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　 利用CCK8實驗、流式細(xì)胞儀檢測，探究抑制NF-κB信號通路活性對L428細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞凋亡和周期的影響。
　　 結(jié)果：
　　 一、Stathmin在B淋巴瘤組織和細(xì)胞株的表達(dá)
　

14、　 1.stathmin在RH病例中主要表達(dá)部位在生發(fā)中心（germinalcentre，GC），且呈強(qiáng)陽性，而套區(qū)基本為陰性，濾泡間區(qū)散在陽性表達(dá);在cHL中H/RS細(xì)胞強(qiáng)陽性表達(dá)，周圍背景細(xì)胞散在強(qiáng)弱不等陽性表達(dá)。stathmin陽性表達(dá)強(qiáng)度在GCB-DLBCL中強(qiáng)于ABC-DLBCL，且呈相對彌漫陽性表達(dá);PCM略強(qiáng)于ABC-DLBCL，且呈現(xiàn)相對散在陽性表達(dá)。
　　 2.stathmin在L428和OCI-Ly8、RP

15、MI-8226和KM3中高表達(dá)，在RPMI-8226和KM3表達(dá)強(qiáng)于L428和OCI-Ly8，在OCI-Ly10中相對低表達(dá)。
　　 二、Stathmin在cHL細(xì)胞株L428和L428-CD99細(xì)胞表達(dá)與定位
　　 1.實時熒光定量RT-PCR、Westernblot檢測顯示，與裸細(xì)胞組和空載體組比較，L428-CD99細(xì)胞亞系CD99基因和蛋白表達(dá)均增高(F=33.311，P=0.013)。
　　 2.wes

16、ternblot和免疫熒光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果顯示過表達(dá)CD99基因L428細(xì)胞stathmin和acetylationα-tubulin表達(dá)顯著增強(qiáng);免疫熒光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果顯示L428、L428-CD99細(xì)胞stathmin與α-tubulin、acetylationα-tubulin表達(dá)部位完全重合;stathmin蛋白定位于細(xì)胞胞膜和胞漿，其中L428細(xì)胞stathmin蛋白表達(dá)主要定位于胞膜的絲足及絲狀肌動蛋白區(qū)域;L42

17、8-CD99細(xì)胞stathmin蛋白在胞漿中的表達(dá)比例相比較L428增高，而在胞膜中的表達(dá)比例相比較L428降低。stathmin參與L428-CD99細(xì)胞骨架重構(gòu)。
　　 3.實時熒光定量RT-PCR、westernblot、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示L428細(xì)胞stathmin和PRDM1表達(dá)相對較弱，L428-CD99細(xì)胞stathmin和PRDM1表達(dá)明顯增強(qiáng)(F=23.834,P=0.020)(F=205.232,P＜0

18、.001)。
　　 三、調(diào)節(jié)stathmin促進(jìn)H/RS細(xì)胞向末端B細(xì)胞方向分化
　　 1.L428細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染siRNA干擾stathmin基因，實時熒光定量RT-PCR檢測干擾組stathmin基因mRNA水平降低(F=47.155，P＜0.001);westernblot檢測干擾組stathmin表達(dá)減弱，PRDM1表達(dá)增強(qiáng)。L428-CD99細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染siRNA干擾stathmin基因，熒光定量RT-PCR檢測

19、干擾組stathmin基因mRNA水平降低(F=47.770，P＜0.001);Westernblot檢測stathmin表達(dá)減弱，PRDM1表達(dá)減弱。
　　 2.L428細(xì)胞干擾stathmin基因，流式細(xì)胞儀檢測干擾組細(xì)胞cHL診斷標(biāo)記(CD15)表達(dá)降低，漿細(xì)胞標(biāo)記(CD38、CD138)表達(dá)明顯增強(qiáng)。
　　 3.L428細(xì)胞干擾stathmin基因后，CCK8實驗檢測干擾stathmin對L428細(xì)胞增殖起抑制作

20、用(F=122.349，P＜0.001;F=1106.644，P＜0.001;F=25.100，P＜0.001)。采用流式細(xì)胞儀檢測干擾組細(xì)胞凋亡率相對增加，細(xì)胞周期停滯在G2/M期。
　　 四、NF-κB信號通路調(diào)控stathmin影響H/RS細(xì)胞向末端B細(xì)胞方向分化
　　 1.L428細(xì)胞添加NF-κB信號通路抑制劑，實時熒光定量RT-PCR檢測干擾組stathmin基因mRNA水平降低(t=30.280，P＜0.0

21、01);Westernblot結(jié)果顯示stathmin表達(dá)減弱，PRDM1表達(dá)增強(qiáng)。L428-CD99細(xì)胞添加NF-κB信號通路激活劑，實時熒光定量RT-PCR檢測干擾組stathmin基因mRNA水平增高(t=-18.082，P＜0.001);Westernblot結(jié)果顯示stathmin表達(dá)增強(qiáng)，PRDM1表達(dá)減弱，CD99表達(dá)無明顯差異。
　　 2.抑制NF-κB信號通路活性，流式細(xì)胞儀檢測處理組細(xì)胞cHL診斷標(biāo)記(CD1

22、5)表達(dá)降低，漿細(xì)胞標(biāo)記(CD38、CD138)表達(dá)明顯增強(qiáng)。
　　 3.抑制NF-κB信號通路活性，CCK8實驗檢測處理組L428-BAY細(xì)胞增殖能力減弱((F=297.382,P＜0.001;F=968.735,P＜0.001;F=71.293,P＜0.001)。采用流式細(xì)胞儀檢測處理組細(xì)胞凋亡率增加，細(xì)胞周期停滯在G1/S期。
　　 結(jié)論：
　　 1.stathmin由生發(fā)中心向生發(fā)中心后分化階段表達(dá)減弱;

23、由生發(fā)中心后向漿細(xì)胞分化階段表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示stathmin可能與B細(xì)胞分化有關(guān)。
　　 2.stathmin參與H/RS細(xì)胞向B細(xì)胞分化過程中細(xì)胞骨架的重構(gòu)。
　　 3.stathmin負(fù)性調(diào)控L428細(xì)胞PRDM1表達(dá)，正性調(diào)控L428-CD99細(xì)胞PRDM1表達(dá)。
　　 4.NF-κB信號通路活性正性調(diào)控stathmin表達(dá)，負(fù)性調(diào)控PRDM1表達(dá)。
　　 5.干擾stathmin基因/抑制NF-

24、κB信號通路活性促使H/RS細(xì)胞CD15表達(dá)降低，漿細(xì)胞標(biāo)記CD38、CD138表達(dá)增強(qiáng)，出現(xiàn)由H/RS細(xì)胞向末端B細(xì)胞分化趨勢，細(xì)胞增殖能力減弱，凋亡率增加。干擾stathmin基因，細(xì)胞周期停滯在G2/M期，抑制NF-κB信號通路活性，細(xì)胞周期停滯在G1/S期。
　　 創(chuàng)新之處：
　　 1.初步揭示stathmin蛋白在成熟B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化過程中的表達(dá)規(guī)律。
　　 2.初步揭示cHL可能通過調(diào)節(jié)NF-κB信