生物防腐劑納他霉素高產(chǎn)菌株選育、發(fā)酵工藝及分離提取技術(shù)研究.pdf

1、納他霉素(Natamycin)是一種高效、廣譜的真菌類抗生素，主要由恰塔努加鏈霉菌(Streptomyces chattanovgensis)、納塔爾鏈霉菌(S.natalensis)和褐黃孢鏈霉菌(S.gilvosporeus)等經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)，能有效地抑制酵母菌和霉菌的生長，在醫(yī)療、食品等方面顯示了良好的應(yīng)用前景。本論文以納塔爾鏈霉菌為試材，重點(diǎn)進(jìn)行了納他霉素的定量分析方法、菌種誘變和選育方法、發(fā)酵工藝及分離提取等方面的研究。

2、對(duì)二劑量管碟法、紫外分光光度法和高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定納他霉素的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行了研究，最終確定高效液相色譜法作為檢測(cè)發(fā)酵液中納他霉素含量的方法。檢測(cè)波長：303nm；流動(dòng)相：甲醇：水：冰乙酸體積比為70：30：2，流速：1.00 mL/min線性回歸方程為Y=12500X+12600，R<'2>=0.9995 精密度試驗(yàn)結(jié)果：平均RSD為0.753％。當(dāng)信噪比為3時(shí)的最小檢測(cè)限為31ng。 利用瓊脂塊法對(duì)S. natale

3、nsis進(jìn)行提取，選擇了發(fā)酵性能較好的SY-4號(hào)菌株作為誘變出發(fā)菌株，搖瓶產(chǎn)量為1.21g/L。 根據(jù)納他霉素的生物合成途徑和代謝調(diào)節(jié)機(jī)理，利用硫酸二乙酯進(jìn)行化學(xué)誘變，分別以硫酸鏈霉素、納他霉素和丙酸鈉作為抗性篩選劑，獲得抗性突變株SY-479，其納他霉素產(chǎn)量達(dá)到1.64g/L。對(duì)SY-479進(jìn)行原生質(zhì)體紫外線誘變，經(jīng)硫酸鏈霉素、納他霉素和丙酸鈉抗性篩選，最終獲得納他霉素高產(chǎn)菌株SY-4795，其搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)2.24g/L，較

4、出發(fā)菌株生產(chǎn)能力提高147％。 搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，種子質(zhì)量對(duì)納他霉素合成具有明顯的影響。在孢子培養(yǎng)時(shí)間7d、斜面冷藏時(shí)間60d以內(nèi)、接種孢子濃度10<'8>個(gè)/mL、種齡32h、接種量2％的條件下，納他霉素的產(chǎn)量達(dá)到最大值，在2.01～2.12 g/L之間。 通過響應(yīng)面分析，得出搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方為：葡萄糖41.02g/L、大豆蛋白胨21.09g/L、酵母浸粉4.46g/L、丙酸鈉1.89g/L。初始pH值7.5；接

5、種量2％，發(fā)酵溫度29℃，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵120h，發(fā)酵產(chǎn)量在2.51～2.68g/L之間。 通過對(duì)7 L自動(dòng)罐分批發(fā)酵代謝過程的分析，確定間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵的流加工藝為：初始葡萄糖濃度40g/L，當(dāng)其降至20g/L時(shí)開始補(bǔ)加50％葡萄糖，平均每隔6h補(bǔ)糖一次，葡糖糖的流加量控制在能維持發(fā)酵液糖濃度在20g/L左右，在整個(gè)發(fā)酵過程中，葡萄糖總流加量為40g/L。最終納他霉素的產(chǎn)量提高到5.02g/L，比分批發(fā)酵提高了

6、66.78％。 控制pH值的7L自動(dòng)罐間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵研究結(jié)果顯示，流加2mol/L的NaOH，將發(fā)酵液pH值控制在5.3～5.4范圍內(nèi)，直到發(fā)酵結(jié)束，使納他霉素產(chǎn)量提高到5.32g/L。 采用固液分離甲醇提取法對(duì)發(fā)酵液中的納他霉素進(jìn)行分離提取，確定固相分離工藝為離心速度10000 r/min、離心時(shí)間20 min，使固相中納他霉素濃度達(dá)到7.72％，占納他霉素總量96.18％，實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵液中的固液分離。納他霉素粗提工藝