血視網(wǎng)膜外屏障的發(fā)育及神經(jīng)視網(wǎng)膜分泌物對緊密連接的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究目的：視網(wǎng)膜由視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）和視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層（neural retina，神經(jīng)視網(wǎng)膜）組成，RPE細(xì)胞頂部的微絨毛與光感受器外節(jié)呈交錯(cuò)對插嵌合，共同組成一個(gè)統(tǒng)一的功能單位，對維持光感受器微環(huán)境發(fā)揮著重要的作用。另外，視網(wǎng)膜存在著內(nèi)、外屏障，視網(wǎng)膜內(nèi)屏障由視網(wǎng)膜毛細(xì)血管管壁內(nèi)皮細(xì)胞之間存在的緊密連接及包裹在內(nèi)皮細(xì)胞外的周細(xì)胞構(gòu)成，而RPE細(xì)胞之間的緊密連接則構(gòu)成了視網(wǎng)膜

2、外屏障，防止脈絡(luò)膜血管叢中的大分子物質(zhì)進(jìn)入到視網(wǎng)膜。正是由于存在著視網(wǎng)膜內(nèi)、外屏障，神經(jīng)視網(wǎng)膜在正常情況下始終保持干燥而透明。其中任何一種屏障發(fā)生障礙，血管中的血漿等成分必會(huì)滲漏入神經(jīng)感覺層內(nèi)，引起視網(wǎng)膜水腫或脫離。 視網(wǎng)膜移植研究表明，若在神經(jīng)視網(wǎng)膜未發(fā)生退化變性前移植RPE細(xì)胞或共同移植RPE細(xì)胞層和感光細(xì)胞層，RPE細(xì)胞往往會(huì)分化良好，若感覺層已發(fā)生變性，單純移植RPE細(xì)胞會(huì)使移植體發(fā)生去分化，而失去RPE細(xì)胞的功能。這說

3、明神經(jīng)視網(wǎng)膜能夠誘導(dǎo)RPE的分化。目前大量關(guān)于視網(wǎng)膜疾病的研究均集中在RPE細(xì)胞層對神經(jīng)視網(wǎng)膜的影響，而后者對前者的調(diào)節(jié)作用則研究甚少。本研究分別從體內(nèi)、體外兩部分入手，利用基因?qū)W手段檢測了RPE細(xì)胞在自身發(fā)育過程中的調(diào)節(jié)變化以及神經(jīng)視網(wǎng)膜對培養(yǎng)的RPE細(xì)胞功能，尤其是屏障功能的影響。并希望從中發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)RPE發(fā)育的關(guān)鍵因素，為將來視網(wǎng)膜疾病的治療，尤其是RPE移植提供理論基礎(chǔ)。 研究方法：本研究利用Affymetrix基因芯片分

4、別檢測不同日齡的雞胚（E7，E10，E14，E18）RPE的基因表達(dá)變化以及神經(jīng)視網(wǎng)膜分泌物對培養(yǎng)的E7，E14 RPE細(xì)胞的基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，利用STEM（Short Time-series Expression Miner）軟件根據(jù)基因在不同發(fā)育時(shí)期，或不同培養(yǎng)條件下的表達(dá)水平進(jìn)行聚類分析（cluster analysis），并在此基礎(chǔ)上利用Gene Ontology分類軟件和Affymetrix軟件進(jìn)行功能分類，根據(jù)基因的共表達(dá)推測

5、某些功能未知基因的生物學(xué)功能。對于我們感興趣的與RPE屏障功能密切相關(guān)的基因，如claudin家族及ZO家族，我們又利用實(shí)時(shí)定量PCR、Western Blot、免疫熒光檢測等方法分別檢測了不同發(fā)育時(shí)期或不同培養(yǎng)條件下它們在mRNA水平、蛋白水平的表達(dá)變化以及在細(xì)胞內(nèi)的分布變化。我們還將通過增加或減少靶基因的表達(dá)對每個(gè)claudin的功能進(jìn)行研究，目前已以claudin20為目標(biāo)做了先鋒實(shí)驗(yàn)，通過siRNA抑制其表達(dá)觀察對培養(yǎng)的RPE細(xì)

6、胞屏障功能的影響。 結(jié)果：在Affymetrix基因芯片上的37694個(gè)探針組（probe sets）中，RPE組織中檢測到20495個(gè)基因表達(dá)，其中8889個(gè)基因的表達(dá)在發(fā)育過程中受到調(diào)節(jié)，4814個(gè)基因的表達(dá)變化具有顯著性意義，并根據(jù)表達(dá)模式分為12類，每一類中的基因具有相似的表達(dá)譜。通過與22個(gè)與緊密連接和粘附連接相關(guān)的基因的實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果對比，僅有2個(gè)基因的表達(dá)與基因芯片檢測結(jié)果有差異。培養(yǎng)細(xì)胞的基因芯片檢測結(jié)果顯示

7、，體內(nèi)所表達(dá)基因的89％和86％分別在E7和E14中表達(dá)，均包括RPE標(biāo)志性基因如RPE65和Bestrophin。其中，在E7細(xì)胞中，15％的基因受到視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層分泌物的調(diào)節(jié)，E14細(xì)胞中，僅約1．9％受到調(diào)節(jié)。通過對其中610個(gè)與RPE功能密切相關(guān)的基因的表達(dá)譜進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的E7和E14細(xì)胞中，分別有17％和6．2％的基因受到視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層的調(diào)節(jié)。神經(jīng)視網(wǎng)膜對于RPE屏障功能的影響則主要體現(xiàn)在對緊密連接跨膜蛋白cla

8、udin家族成員的調(diào)節(jié)。除對該家族蛋白在mRNA水平的調(diào)節(jié)外，Western Blot和免疫細(xì)胞化學(xué)顯示視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層分泌物可能對claudins在蛋白水平還存在著不同的調(diào)節(jié)機(jī)制。 結(jié)論：基因芯片技術(shù)為我們所提供的對于RPE細(xì)胞發(fā)育及與其周圍環(huán)境相互作用的動(dòng)態(tài)認(rèn)識(shí)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出我們基于形態(tài)學(xué)檢查的預(yù)期結(jié)果。細(xì)胞頂端緊密連接復(fù)合體的逐步成熟、細(xì)胞外基質(zhì)相互作用以及跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)能力的逐步健全都揭示了視網(wǎng)膜發(fā)育過程中血視網(wǎng)膜屏障的逐步建立

9、及完善過程。這些數(shù)據(jù)為我們評價(jià)RPE細(xì)胞培養(yǎng)模型成功與否提供了一個(gè)更值得信賴的標(biāo)準(zhǔn)。原代培養(yǎng)的胚胎RPE細(xì)胞的基因表達(dá)與正常組織相似，尤其在細(xì)胞上房培養(yǎng)基中引入正常視網(wǎng)膜細(xì)胞生存環(huán)境中的成分后，細(xì)胞的分化水平及基因的表達(dá)水平更接近于體內(nèi)正常組織。對于不成熟的RPE細(xì)胞（E7），神經(jīng)視網(wǎng)膜分泌物可以促進(jìn)其分化；而對于已成熟的RPE細(xì)胞（E14），則主要表現(xiàn)為維持其生物學(xué)特性。通過對TJ蛋白claudin家族在mRNA及蛋白水平的研究發(fā)現(xiàn)，