生防枯草芽胞桿菌NCD-2菌株豐產(chǎn)素合成和生物膜形成相關(guān)基因的功能分析.pdf

1、生防枯草芽胞桿菌NCD-2菌株是微生物殺菌劑“10億芽胞/克枯草芽胞桿菌可濕性粉劑”的主要成分，對(duì)灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）大麗輪枝菌（Verticillium dahlia）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）等病原菌引起的作物病害具有良好的防治效果。前期研究表明，NCD-2菌株主要通過產(chǎn)生脂肽類抑菌物質(zhì)——豐產(chǎn)素(fengycin)和有效的根際定

2、殖而達(dá)到理想的防病效果，而該菌株的根際定殖能力與其生物膜形成相關(guān)。為了進(jìn)一步明確NCD-2菌株防治土傳病害的作用機(jī)制，本研究采用分子遺傳學(xué)技術(shù)、基因表達(dá)譜芯片技術(shù)(DNA microarray)和微生物表型芯片技術(shù)(Phenotype Microassays，PM)對(duì)NCD-2菌株豐產(chǎn)素合成和生物膜形成相關(guān)基因進(jìn)行了功能分析和調(diào)控研究，主要結(jié)果如下:
　　1.明確ComA是NCD-2菌株豐產(chǎn)素合成和生物膜的形成過程中重要的調(diào)控因子

3、
　　為明確群體感應(yīng)系統(tǒng)在NCD-2菌株抑菌活性和生物膜形成中的作用，克隆獲得了群體感應(yīng)系統(tǒng)基因comQ、comX、 comP和comA的全長序列（GeneBank登錄號(hào)分別為GQ924946、GQ924947、GQ924948和GQ924945）。通過同源重組技術(shù)對(duì)群體感應(yīng)系統(tǒng)中的調(diào)控因子ComA基因進(jìn)行定位缺失突變，分別比較了NCD-2菌株和comA突變子在胞外酶合成、抑菌活性、豐產(chǎn)素合成以及生物膜形成上的差異，并進(jìn)一步利用實(shí)

4、時(shí)熒光定量PCR技術(shù)比較了二者生物膜基質(zhì)編碼基因epsA和tasA的表達(dá)情況。結(jié)果表明，同NCD-2菌株野生型相比，comA缺失突變子在胞外蛋白酶和纖維素酶的合成能力、對(duì)番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)的抑菌活性、豐產(chǎn)素的合成量和生物膜形成能力上均明顯下降，且生物膜基質(zhì)編碼基因tasA的表達(dá)量下降了70％，而eps的表達(dá)量變化不明顯。以上結(jié)果表明ComA是NCD-2菌株豐產(chǎn)素合成和生物膜形成中的重要調(diào)控因子。
　　2

5、.明確DegQ是NCD-2菌株豐產(chǎn)素產(chǎn)生和生物膜的形成過程中重要的調(diào)控因子
　　為明確DegQ在枯草芽胞桿菌NCD-2菌株抑菌活性和生物膜形成中的作用，克隆獲得了degQ基因（GeneBank登錄號(hào)GQ924949），該基因全長141 bp，通過同源重組技術(shù)和互補(bǔ)技術(shù)對(duì)degQ進(jìn)行定位缺失突變和功能互補(bǔ)。分別比較了NCD-2菌株野生型及其衍生菌株在胞外酶合成、抑菌活性、豐產(chǎn)素產(chǎn)生及生物膜形成上的差異，并進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR

6、技術(shù)比較了NCD-2菌株野生型及其衍生菌株豐產(chǎn)素合成酶編碼基因fenA的表達(dá)情況。結(jié)果表明，同NCD-2菌株野生型相比，degQ基因缺失突變子在胞外蛋白酶和纖維素酶的合成能力和豐產(chǎn)素的合成量均明顯下降，且豐產(chǎn)素合成酶編碼基因fenA的表達(dá)量降低至原來的1/2，對(duì)番茄灰霉菌的抑菌活性和生物膜形成能力上均顯著下降。而互補(bǔ)菌株的這些性狀全部恢復(fù)至野生型水平。以上結(jié)果表明DegQ是NCD-2菌株脂肽抗生素和生物膜形成中的重要調(diào)控因子。
　

7、　3.明確DegQ影響NCD-2菌株的抗?jié)B透壓能力和氨基酸脫羧酶的產(chǎn)生能力
　　利用表型芯片(Phenotype Microarray，PM)技術(shù)分別測(cè)定了NCD-2菌株野生型和degQ突變子在利用碳源代謝、氮源（氨基酸和短肽）代謝、磷源代謝、硫源代謝、生物合成途徑、抗?jié)B透壓、不同pH值的底物條件下的細(xì)胞表型差異。結(jié)果表明，NCD-2菌株和突變子在碳源代謝、氮源代謝、硫源代謝、磷源代謝及生物合成途徑方面差異不大。在底物為pH5.2

8、100 mM苯甲酸鈉時(shí)，degQ突變子表現(xiàn)出的滲透壓抗性明顯強(qiáng)于NCD-2菌株。NCD-2菌株和degQ突變子在pH4.5下的產(chǎn)氨基酸脫羧酶方面表現(xiàn)出明顯差異，當(dāng)?shù)孜餅長-亮氨酸，NCD-2菌株野生型能夠產(chǎn)生L-亮氨酸脫羧酶對(duì)底物進(jìn)行脫羧反應(yīng)，而degQ突變后，突變子喪失了對(duì)L-亮氨酸的脫羧能力。NCD-2菌株不能產(chǎn)生L-異亮氨酸、L-色氨酸、L-正亮氨酸脫羧酶，而degQ突變后，突變子增強(qiáng)了L-異亮氨酸、L-色氨酸、L-正亮氨酸脫羧酶

9、活性，表明DegQ可能正調(diào)控L-亮氨酸脫羧酶，負(fù)調(diào)控L-異亮氨酸、L-色氨酸、L-正亮氨酸脫羧酶的合成。
　　4.明確ywbB基因正調(diào)控NCD-2菌株生物膜形成和胞外基質(zhì)編碼基因的表達(dá)
　　前期試驗(yàn)證明突變ywbB后NCD-2菌株喪失了生物膜形成能力。利用RT-qPCR（Reverse transcription quantitative real-time PCR，RT-qPCR）技術(shù)測(cè)定生物膜狀態(tài)下NCD-2菌株和ywb

10、B突變子tasA和epsA基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ywbB突變子中的tasA和epsA基因的表達(dá)量相對(duì)于NCD-2菌株野生型的表達(dá)量分別下降了64％和85％，表明ywbB基因正調(diào)控tasA和epsA基因的表達(dá)。
　　5.基因芯片技術(shù)分析獲得NCD-2菌株中受ywbB調(diào)控并與生物膜形成相關(guān)的基因
　　利用基因芯片技術(shù)對(duì)產(chǎn)生生物膜狀態(tài)下的NCD-2菌株野生型和ywbB突變子基因組中4206個(gè)基因進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，得到37個(gè)與生物

11、膜形成相關(guān)并受ywbB上調(diào)的基因，42個(gè)與生物膜形成相關(guān)并受ywbB下調(diào)的基因。利用RT-qPCR技術(shù)測(cè)定了其中5個(gè)基因tasA（編碼芽胞蛋白）、epsA（編碼胞外多糖）、sspB（編碼酸溶性芽胞蛋白）、sipW（編碼Ⅰ型信號(hào)肽酶W）、spoIIAA（編碼抗-抗δF因子）、cotJC（編碼芽胞衣多肽組分）在NCD-2菌株野生型和ywbB突變子中的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于在NCD-2菌株中的表達(dá)量，tasA、sspB、sipW、spoII

12、AA和cotJC基因在突變子中的表達(dá)量均顯著下降了64％、99％、77％、79％、97％，與基因芯片測(cè)定的結(jié)果一致。
　　6.明確3個(gè)受ywbB調(diào)控并與生物膜形成相關(guān)基因spoIIAA、sipW和cotJC的功能
　　通過對(duì)枯草芽胞桿菌NCD-2菌株全基因組進(jìn)行序列分析，克隆得到sipW、spoIIAA、cotJC基因全序列，大小分別為573 bp、354 bp、570 bp。利用同源重組技術(shù)對(duì)spoIIAA、sipW和co

13、tJC基因進(jìn)行定位缺失突變。分別比較了NCD-2菌株野生型和突變子在生物膜形成、抑菌活性、根際定殖上的差異，結(jié)果表明sipW和spoIIAA基因突變子在生物膜形成、抑菌活性、根際定殖能力以及對(duì)棉花立枯病的防效方面同NCD-2菌株野生型相比均明顯下降，而cotJC基因突變子的上述性狀同NCD-2菌株野生型相比差別均不明顯。
　　由此得出以下結(jié)論:(1)群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控基因comA及其多效調(diào)控基因degQ在枯草芽胞桿菌NCD-2菌株豐