大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的實驗研究.pdf

1、一、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及其生物學(xué)特性的實驗研究。 目的： 建立一種簡單，快速的分離、純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并適宜其在體外大量快速增殖的方法；進(jìn)一步了解骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的各種生物學(xué)特性。 方法： 1、無菌條件下取大鼠雙側(cè)股骨、脛骨和胸骨，并用吸取D-Hank's液的注射器沖出骨髓細(xì)胞，置于含10％FBS、100U/ml雙抗的L-DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5％CO<,2>環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，應(yīng)用全骨髓

2、培養(yǎng)法結(jié)合貼壁分離的方法進(jìn)行純化。待細(xì)胞達(dá)95％融合時，用0.125％的胰酶-0.02％的EDTA消化2-3min后進(jìn)行傳代。倒置顯微鏡下觀察原代及傳代后的細(xì)胞生長特點。 2、掃描電鏡(SEM)下觀察大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面的超微結(jié)構(gòu)特征。 3、HE染色光鏡觀察大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)特征。 4、用MTT法測定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線，從而進(jìn)一步了解其生長特性。 結(jié)果： 原代培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞

3、成分復(fù)雜，1-2天開始有少量細(xì)胞貼壁，形狀不規(guī)則，有長梭形、多角形等。半量換液后，克隆生長的細(xì)胞團(tuán)塊開始迅速增殖，以集落形式生長為主。7-9天左右細(xì)胞可長滿培養(yǎng)瓶底，達(dá)95％以上融合，主要呈紡錘形，其中散在少量折光性強(qiáng)的小圓形細(xì)胞。細(xì)胞整體排列更趨于規(guī)律性，呈漩渦狀，輻射狀或魚群樣排列。傳代后的細(xì)胞貼壁及生長更加迅速，2h后部分細(xì)胞即開始貼壁，24h內(nèi)即可完全貼壁，6-7天可鋪滿培養(yǎng)瓶底。細(xì)胞形態(tài)更均一，紡錘形生長，整體呈現(xiàn)漩渦狀，輻射

4、狀或魚群樣排列。傳代10代以上，各代之間細(xì)胞生長均一，穩(wěn)定。HE染色示胞體以紡錘形居多，有突起。細(xì)胞核大、居中深染，嗜堿性，核仁明顯；胞質(zhì)著色淺，呈弱嗜酸性。P2、P4、P6細(xì)胞生長曲線基本相同，分為潛伏期(第1-2天)、對數(shù)生長期(第3—5天)和平臺期(第6-7天)，且?guī)状?xì)胞間生長狀況穩(wěn)定。掃描電鏡下可見到三種形態(tài)的細(xì)胞：以寬大扁平形的細(xì)胞為主，長梭形和圓球形細(xì)胞占少數(shù)。胞體周圍的突起類似樹枝狀，并互相重疊，相互交織。細(xì)胞核大，圓形

5、或橢圓形，核仁1-5個不等。表面可見大量短而粗的微絨毛樣突起。結(jié)論：1本部分應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)法結(jié)合貼壁分離法成功建立了一種體外簡單、快速的分離、純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，并使其在體外迅速得到了增殖，而且性狀穩(wěn)定。2細(xì)胞呈均一的紡錘形；P2、P4、P6細(xì)胞生長曲線基本相同，細(xì)胞增殖快，且?guī)状?xì)胞間生長狀況穩(wěn)定。3掃描電鏡下可見到三種形態(tài)的細(xì)胞：以寬大扁平形的細(xì)胞為主，長梭形和圓球形細(xì)胞占少數(shù)。細(xì)胞表面可見大量短而粗的微絨毛樣突起，推測

6、這樣的結(jié)構(gòu)特征可能更有利于細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)交換。 二、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的實驗研究 目的： 體外定向誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。 方法： 1、按照第一部分的方法收集大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分離、純化、培養(yǎng)、傳代。 2、分別取不同代數(shù)對數(shù)生長期的細(xì)胞，應(yīng)用二甲基亞砜(DMSO)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)對其進(jìn)行不同方式的誘導(dǎo)。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色及wes

7、tern blot的方法鑒定誘導(dǎo)后的細(xì)胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和神經(jīng)微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)的表達(dá)。 結(jié)果： 對照組：細(xì)胞在預(yù)誘導(dǎo)和正式誘導(dǎo)過程中細(xì)胞形態(tài)均無明顯變化，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示NSE為陰性表達(dá)。實驗組：細(xì)胞在24h的預(yù)誘導(dǎo)中形態(tài)無明顯變化，正式誘導(dǎo)后1h細(xì)胞胞體開始向胞核收縮，呈圓形；3h后胞體圓形呈典型的核質(zhì)體形態(tài)，并開始長出1-3個細(xì)胞突起；5h后突起不斷延長

8、，出現(xiàn)2-3級突起并相互交錯；7h后胞體圓形，伸出的2-3級突起相互交織成網(wǎng)狀。其中含血清誘導(dǎo)組中細(xì)胞誘導(dǎo)5h開始有部分細(xì)胞漂浮死亡現(xiàn)象，而無血清誘導(dǎo)組則無此現(xiàn)象。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：未行預(yù)誘導(dǎo)的兩組中，培養(yǎng)基中有血清組與無血清組的誘導(dǎo)率分別為：71.857±7.08249％、72.597±6.98511％。應(yīng)用1％DMSO+10ng/ml bFGF+無血清L-DMEM預(yù)誘導(dǎo)24h，10ng/mlbFGF+10％DMSO+無血清L-D

9、MEM正式誘導(dǎo)7 h的細(xì)胞NSE的表達(dá)率為86.67±5.5148％。GFAP和MAP-2在各時間點均表達(dá)陰性。western blot結(jié)果顯示誘導(dǎo)后細(xì)胞NSE在0h、3h、5h、7h的表達(dá)(與β-actin的比值)分別為0.232±0.00364、0.3141±0.00414、0.321±0.00186、0.4683±0.00447。 結(jié)論： 1、應(yīng)用1％DMSO+10ng/ml bFGF+無血清L-DMEM預(yù)誘導(dǎo)2

10、4h，10ng/mlbFGF+10％DMSO+無血清L-DMEM正式誘導(dǎo)7 h可以誘導(dǎo)MSC分化成為神經(jīng)元樣細(xì)胞，并達(dá)到最大的誘導(dǎo)率86.67％。 2、應(yīng)用1％DMSO+10ng/mlbFGF+無血清L-DMEM預(yù)誘導(dǎo)24h，可顯著提高M(jìn)SC向神經(jīng)元樣細(xì)胞的誘導(dǎo)率。 3、誘導(dǎo)液中無血清可延長誘導(dǎo)后細(xì)胞的生存時間。 三、BrdU體外標(biāo)記大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實驗研究。 目的： 探討連續(xù)培養(yǎng)的骨髓間

11、充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用BrdU標(biāo)記的穩(wěn)定性、最佳階段、時間和劑量，從而達(dá)到應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行研究最好的示蹤目的。 方法： 1、按照第一部分的方法收集大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分離、純化、培養(yǎng)、傳代。 2、取不同代數(shù)的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片，在細(xì)胞生長的不同時期、應(yīng)用不同濃度的BrdU標(biāo)記不同時間后，用免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法進(jìn)行鑒定。 結(jié)果： 1、對P2、P4、P6的MSC進(jìn)行BrdU標(biāo)記，其標(biāo)記率分別為94.

12、868±3.739％、95.696±3.952％、94.774±3.565％。 2、對生長至第2、4、6天的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記率分別為60.286±6.197％、96.175±3.689％、65.017±5.982％。 3、對細(xì)胞標(biāo)記24h、48h、72h時，標(biāo)記率分別為58.895±10.025％、95.375±4.136％、94.835±2.970％。 4、分別應(yīng)用BrdU濃度為5μmol/L、10μmol/