嗜酸熱硫化葉菌Sulfolobus acidocaldarius基因敲除體系的構(gòu)建.pdf

1、極端嗜熱古菌硫化葉菌屬是古菌中最好的研究材料之一，但是其有效的基因敲除系統(tǒng)還有待構(gòu)建和發(fā)展.這個問題一直阻礙著該模式生物更深一步的遺傳學研究。 本研究的目的是以古菌模式種Sulfolobusacidocaldarius為出發(fā)菌株，構(gòu)建一套基因敲除體系。對于S.acidocaldarius，目前已經(jīng)有一種有效的選擇標記用于篩選其pyrEF缺失突變株。因此，我們希望構(gòu)建其pyrEF缺失突變株,并作為宿主菌去檢測pyrEF互補的遺傳表

2、達，檢測pyrEF是否可以作為一種選擇標記用于該模式古菌的基因敲除分析.本研究通過遺傳重組方式構(gòu)建pyrEF突變株，而E.coli載體pUC19用于構(gòu)建基因敲除質(zhì)粒.以S.acidocaldarius基因組DNA為模板擴增pyrEF同源臂，并將以上DNA片段插入到pUC19，得到pyrEF敲除質(zhì)粒pEFD。用pEFD轉(zhuǎn)化S.acidocaldarius，在涂有5-FOA平板上長出抗5-FOA的pyrEF突變株轉(zhuǎn)化子.在挑取的121個轉(zhuǎn)化

3、子中,有一個pyrEF基因缺失963-bp的突變株,其突變等位基因pyrE上保留122-bp序列,在pyrEF上保留155-bp。該突變株被命名為DEF-963，作為宿主菌用于檢測遺傳體系。 為了檢測pyrEFMarker在基因敲除突變株中的有效性,本研究通過“Markerless”基因缺失實驗將DEF-963基因組中的bgaS基因缺失掉。Marker基因以S.solfatarius基因組DNA為模板通過PCR擴增得到，bgaS

4、同源臂以S.acidocaldarius基因組DNA為模板PCR擴增得到，將以上所有片段插入到pUC19，得到bgaS基因敲除質(zhì)粒pSD.用pSD轉(zhuǎn)化DEF-963,轉(zhuǎn)化子在缺少尿嘧啶的平板上形成菌落，而DEF-963則不能長出.挑取4個轉(zhuǎn)化子抽提總DNA，用PCR進行檢測，其中有2個在突變的bgaS等位基因處呈現(xiàn)出期望的條帶大小，這樣，就得到了pyrEF、bgaS雙缺失突變株。為了驗證該突變株，將該突變株基因組進行了Southern雜

5、交分析，只有預(yù)期的突變基因的等位基因才能被探針雜交上.結(jié)果顯示，得到的突變株確實為pyrEF、bgaS雙缺失突變株。 本系統(tǒng)應(yīng)用，需要構(gòu)建目的基因敲除載體.該載體中需在要敲除目的基因兩側(cè)加入S.solfataricus基因組中的pyrEF和lacS基因序列,進行轉(zhuǎn)化后，將細胞置于不含尿嘧啶和以乳糖為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng).只有發(fā)生了雙交換，S.solfataricus中的pyrEF和lacS互補序列整合到DEF-964基因組