STY39對(duì)人肺Ⅱ型上皮細(xì)胞系A(chǔ)549表達(dá)炎癥因子的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、α-黑素細(xì)胞刺激素(α-melanocyte-stimulating hormone，α-MSH)是一種內(nèi)源性小分子神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)肽，其能促進(jìn)黑色素形成，有明顯的退熱、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。α-MSH的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用一直是神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。α-MSH對(duì)一部分早期炎癥因子有明顯的抑制作用，國(guó)外和我們以往的研究均顯示，α-MSH對(duì)實(shí)驗(yàn)性致死性內(nèi)毒素血癥、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratorydist

2、ress syndrome，ARDS)有顯著的保護(hù)作用。我們前面的研究還顯示其對(duì)晚期炎癥因子也有很好的抑制作用。α-MSH的受體為黑素皮質(zhì)受體(melanocyte receptor)，有五種亞型，分別命名為MC1～5R，均屬于Ⅰ型G蛋白耦聯(lián)受體家族，具有七次跨膜結(jié)構(gòu)。α-MSH通過(guò)結(jié)合黑皮質(zhì)素受體(MC1R，MC3R，MC4R和MC5R)來(lái)發(fā)揮作用，MC1R和MC5R主要介導(dǎo)其抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，MC3R和MC4R主要參與α-MSH對(duì)

3、飲食、體重以及能量代謝平衡的調(diào)節(jié)。但是α-MSH作為抗炎免疫調(diào)節(jié)劑，本身存在缺點(diǎn)，其對(duì)MC1R和MC3R選擇性較高，對(duì)MC4R和MC5R親和力很低。雖然目前[Nle4,D-Phe7]α-MSH(NDP-MSH)是較為理想的α-MSH抗炎類(lèi)似物之一，具有高效、作用持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、蛋白水解酶抵抗性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、可溶性好等優(yōu)點(diǎn)，已用于Ⅰ期臨床試驗(yàn)，但是NDP-MSH對(duì)受體選擇性不高，對(duì)其他生理功能可能會(huì)產(chǎn)生影響，對(duì)MC1R的高親和力導(dǎo)致其有明顯的

4、色素沉著作用。本教研室自主研制了新型α-MSH類(lèi)似物(專(zhuān)利授權(quán)號(hào)ZL200510026927.3，命名：STY39)，前期研究已經(jīng)證明其具有MC1R和MC5R選擇性，STY39在更好地發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用的同時(shí)盡量減輕其副作用。
　　 國(guó)外和我們以往關(guān)于α-MSH和STY39的抗炎作用和機(jī)制的研究對(duì)象主要集中在血液中的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞上。我們以往的研究顯示，STY39對(duì)實(shí)驗(yàn)性致死性內(nèi)毒素血

5、癥、失血性休克加LPS二次打擊導(dǎo)致的急性肺損傷(acute lung iniury，ALI)有顯著的保護(hù)作用，但STY39對(duì)于ALI時(shí)肺部的實(shí)質(zhì)細(xì)胞如肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cell，AEC)尤其是Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cell typeⅡ，AECⅡ或ATⅡ)的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用及其相關(guān)機(jī)制方面的研究則未涉及。ALI是指機(jī)體遭受?chē)?yán)重感染、創(chuàng)傷、休克等打擊后，出現(xiàn)的以彌漫性

6、肺泡毛細(xì)血管膜損傷導(dǎo)致的肺水腫和微肺不張為病理特征的一種肺部炎癥和通透性增加綜合征，ARDS是一種嚴(yán)重的ALI。ALI后真正的臨床治療難點(diǎn)是炎癥消退后的肺纖維化。AEC是肺組織的結(jié)構(gòu)細(xì)胞，其中ATⅡ是肺的重要結(jié)構(gòu)細(xì)胞，具有干細(xì)胞的性質(zhì)及分泌表面活性物質(zhì)維持肺泡表面張力，增殖分化成肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞，修復(fù)肺損傷等能力，對(duì)維持肺泡的正常結(jié)構(gòu)和功能有重要意義。ATⅡ細(xì)胞雖不屬于“傳統(tǒng)”意義上的免疫細(xì)胞，但因其在各種生理及病理?xiàng)l件下能表達(dá)主要組織

7、相容性復(fù)合物(MHC)Ⅱ類(lèi)分子，分泌多種細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)，參與炎癥細(xì)胞的相互作用，故被看作為一類(lèi)重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，起到肺部免疫調(diào)節(jié)和防御的作用。在炎癥過(guò)程中，受炎癥因子的刺激，ATⅡ亦能分泌產(chǎn)生多種炎癥因子，在ALI和ARDS以及肺纖維化進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。因此，研究STY39對(duì)炎癥狀態(tài)下的ATⅡ是否有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用及其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)深入了解和闡明ALI和ARDS以及肺纖維化這些疾病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸都有深刻的意義。我們選取人肺Ⅱ

8、型上皮細(xì)胞系A(chǔ)549(即人肺腺癌細(xì)胞系)為研究對(duì)象，從肺上皮細(xì)胞的角度進(jìn)一步揭示STY39抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用及其相關(guān)機(jī)制，為后續(xù)STY39進(jìn)入臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 第一部分 STY39對(duì)LPS誘導(dǎo)人肺Ⅱ型上皮細(xì)胞系A(chǔ)549表達(dá)炎癥因子的調(diào)節(jié)作用
　　 目的：觀察STY39對(duì)LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞表達(dá)的炎癥因子是否有調(diào)節(jié)作用。
　　 方法：利用體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞作為研究對(duì)象，按照對(duì)照組、LPS刺激組、STY

9、39(10-6mol/L、10-8mol/L、10-10 mol/L、10-12mol/L)組、α-MSH(10-6mol/L、10-8mol/L、10-10 mol/L、10-12 mol/L)組分組，作用不同時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法和ELISA法檢測(cè)早期炎癥因子IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA和蛋白表達(dá)水平；通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法和Western Blot法檢測(cè)晚期炎癥因子高遷移率

10、族蛋白B1(high mobility group-box1，HMGB1)的mRNA和蛋白表達(dá)水平；ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中胞外分泌的HMGB1；以人單核細(xì)胞系U937進(jìn)行細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)A549細(xì)胞對(duì)U973細(xì)胞的黏附能力；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法以及FACS檢測(cè)黏附分子ICAM-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平； ELISA法檢測(cè)A549細(xì)胞產(chǎn)生肺表面活性蛋白-D(surfactant protein-D，SP-D)的水平。結(jié)果

11、：本研究發(fā)現(xiàn)STY39可顯著降低A549細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后分泌的早期炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的蛋白和mRNA水平的表達(dá)，增強(qiáng)IL-4的表達(dá)。LPS可刺激A549細(xì)胞釋放HMGB1，但其mRNA表達(dá)水平的改變較其蛋白表達(dá)水平的改變滯后很多。STY39可降低A549細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)HMGB1蛋白表達(dá)以及胞外分泌水平，對(duì)HMGB1mRNA的表達(dá)也有一定抑制作用。STY39可減少A549細(xì)胞對(duì)U937細(xì)胞的黏附，并能顯著抑

12、制A549細(xì)胞表達(dá)ICAM-1。SP-D是ATⅡ和氣道Clara細(xì)胞合成并分泌的一類(lèi)蛋白，是肺部重要的天然免疫防御分子，A549細(xì)胞自分泌高水平的SP-D，STY39可促進(jìn)SP-D的分泌。結(jié)論：STY39能顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的早期和晚期炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)IL-4和SP-D的分泌，與α-MSH相比，STY39抑制炎癥和免疫調(diào)節(jié)的作用更強(qiáng)。
　　 第二部分 STY39抑制人肺Ⅱ型上皮細(xì)胞系A(chǔ)549表達(dá)炎癥因子的相關(guān)分子機(jī)制

13、r>　　 目的：探討STY39抑制A549產(chǎn)生炎癥因子的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。方法：體外培養(yǎng)A549細(xì)胞，按照對(duì)照組、LPS刺激組、STY39(10-8mol/L)組、α-MSH(10-8mol/L)組分組，半定量RT-PCR檢測(cè)A549細(xì)胞上MC1R、MC2R、MC3R、MC4R、MC5R受體的組成性表達(dá)分布情況，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)其受LPS刺激后和分別加入不同濃度的STY39和α-MSH處理后MC1～MC5R的mRNA表達(dá)變

14、化情況；通過(guò)Westren Blot檢測(cè)各組磷酸化Erk、磷酸化JNK、磷酸化P38、NF-κB p65和IκBα的蛋白水平表達(dá)情況；雙熒光報(bào)告基因法檢測(cè)STY39對(duì)LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞內(nèi)NF-κB轉(zhuǎn)錄水平變化的影響。結(jié)果：對(duì)A549細(xì)胞表面MC1R～MC5R表達(dá)的初步研究發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞組成性表達(dá)MC1R～MC5R，以MC1R表達(dá)最高，MC5R次之，MC2R～MC4R表達(dá)較弱；LPS刺激后，發(fā)現(xiàn)MC5R的mRNA表達(dá)水平顯著升高

15、，MC1R其次，其他三型受體mRNA水平變化不明顯；Western Blot結(jié)果顯示，STY39作用A549細(xì)胞后部分抑制磷酸化Erk、磷酸化JNK、磷酸化P38、NF-κB p65的活化，抑制胞漿內(nèi)IκBα的降解，比α-MSH的抑制作用更強(qiáng)；雙熒光報(bào)告基因法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，STY39明顯抑制胞內(nèi)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)論：STY39可能通過(guò)A549細(xì)胞表達(dá)的MCRs經(jīng)MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑部分抑制LPS誘導(dǎo)的A5