七甲川花菁類熒光小分子IR-780對耐藥腫瘤細(xì)胞殺傷作用的實驗研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　惡性腫瘤是目前嚴(yán)重威脅人類健康的主要的疾病之一。隨著對腫瘤研究的不斷深入,其診斷和治療手段有了很大的發(fā)展。但是,由于腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等基本問題沒有得到解決,其治療效果的提高并不明顯,以至于腫瘤的復(fù)發(fā)率和病死率居高不下。新近的研究認(rèn)為,腫瘤是由不同類型以及分化程度不同的腫瘤細(xì)胞組成的異質(zhì)性組織,其中包含一小部分具有耐藥性的腫瘤細(xì)胞(Drug-resistant cancer cells),它們具有自我更新能力,侵

2、襲和遷移能力,并且能夠形成不同分化程度的腫瘤細(xì)胞,也有研究稱其為腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells,CSCs)。耐藥腫瘤細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根本原因。因此,針對耐藥腫瘤細(xì)胞的靶向性治療將使最終攻克腫瘤成為可能,受到了研究者的廣泛關(guān)注。目前,針對腫瘤靶向性治療的研究策略通常是通過化學(xué)連接的方法將不同的腫瘤靶向性配體(包括小分子物質(zhì)、多肽、單克隆抗體和腫瘤特異性表面標(biāo)志物)和抗腫瘤藥物進(jìn)行連接,或者采用納米材料與抗腫瘤藥

3、物連接的方法,利用納米材料的腫瘤組織透過性增強(qiáng)及滯留效應(yīng)(EPR效應(yīng)),將化療藥物特異性地轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤組織中而發(fā)揮抗腫瘤作用。然而,從目前的一些腫瘤靶向性治療研究結(jié)果來看,由于在體內(nèi)的反應(yīng)性與體外試驗條件下并不完全相同,且通過連接后各活性基團(tuán)的功能可能發(fā)生改變。多數(shù)通過化學(xué)連接的抗腫瘤藥物對腫瘤的靶向性并不強(qiáng),且對耐藥腫瘤細(xì)胞殺傷作用不顯著,因此在體內(nèi)的抗腫瘤效果往往都不太令人滿意。本課題組前期的研究報道了具有近紅外熒光特性的七甲川花菁類

4、小分子化合物IR-780在體內(nèi)對腫瘤組織具有特異性識別能力,包括在移植瘤模型和化學(xué)藥物誘導(dǎo)成瘤的動物模型中對腫瘤組織均具有良好的靶向成像作用。IR-780是一種親脂性小分子,能夠選擇性地在腫瘤細(xì)胞的線粒體中蓄積。本課題在前期的工作基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究IR-780對腫瘤細(xì)胞可能的殺傷作用,并探討其相關(guān)機(jī)制。
　　主要研究內(nèi)容包括三部分:
　　1、IR-780對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。體外通過與臨床抗腫瘤藥物5-Fu和ADM比較研究

5、IR-780對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,以明確 IR-780對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性,進(jìn)一步研究其對敏感腫瘤細(xì)胞的周期分布,自我更新能力,遷移能力和細(xì)胞凋亡的影響及其在動物荷瘤模型中的抗腫瘤作用。
　　2、通過化療藥物聯(lián)合無血清懸浮培養(yǎng)的方法分離并鑒定耐藥腫瘤細(xì)胞。采用抗腫瘤藥物 ADM聯(lián)合無血清懸浮培養(yǎng)的方法從人腫瘤細(xì)胞系 A549中成功分離出了耐藥的腫瘤細(xì)胞(A549/DR細(xì)胞),并對其耐藥性,細(xì)胞周期分布,遷移能力,自我更新能力及干細(xì)

6、胞特異性標(biāo)志物Sox2和Oct4的表達(dá)情況進(jìn)行鑒定,以為后續(xù)研究提供細(xì)胞模型。
　　3、應(yīng)用A549/DR細(xì)胞模型研究IR-780對耐藥腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。通過與化療藥物5-Fu、ADM比較,體外研究IR-780對A549/DR細(xì)胞的殺傷作用以及對細(xì)胞自我更新能力和遷移能力的影響;通過建立動物荷瘤模型,觀察IR-780對腫瘤復(fù)發(fā)和耐藥腫瘤細(xì)胞二次成瘤能力的影響;進(jìn)一步探討IR-780對A549/DR細(xì)胞選擇性蓄積能力,及其對耐藥腫

7、瘤細(xì)胞線粒體功能和細(xì)胞凋亡的影響。
　　主要研究結(jié)果包括:
　　1、檢測了IR-780對A549、H460、HepG2、U251、MCF-7五種腫瘤細(xì)胞的半數(shù)致死劑量IC50,發(fā)現(xiàn)IR-780對肺癌細(xì)胞A549殺傷作用最為顯著,并對細(xì)胞增殖周期,自我更新能力和遷移能力均有抑制作用,顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步觀察到IR-780在較高濃度(20μM)時對常規(guī)抗腫瘤藥物5-Fu和ADM耐藥的腫瘤細(xì)胞也具有殺傷作用。本實驗揭示IR-7

8、80在較高劑量下可對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用,特別是對耐藥腫瘤細(xì)胞的殺傷具有潛在的意義。
　　2、通過低劑量ADM聯(lián)合無血清懸浮培養(yǎng)的方法從A549細(xì)胞系中分離出呈懸浮球生長的A549/DR細(xì)胞。經(jīng)鑒定A549/DR細(xì)胞具有耐藥腫瘤細(xì)胞的特征,包括:對5-Fu和ADM的耐藥性顯著增強(qiáng),其中90.11％的細(xì)胞處于G1期,具有較強(qiáng)的自我更新能力和遷移能力,同時表達(dá)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物 Oct4和 Sox2。本實驗為后續(xù)研究IR-780對耐藥

9、腫瘤細(xì)胞的殺傷作用提供了細(xì)胞模型。
　　3、與化療藥物5-Fu和ADM比較,IR-780(20μM)對耐藥腫瘤細(xì)胞A549/DR表現(xiàn)出更強(qiáng)的殺傷作用,且對 A549/DR細(xì)胞的自我更新能力和遷移能力抑制作用更明顯。在動物體內(nèi)實驗中進(jìn)一步證明了 IR-780對腫瘤生長的抑制作用比 ADM和 CTX更顯著,并能夠明顯延緩腫瘤的復(fù)發(fā),且IR-780治療后的腫瘤細(xì)胞二次成瘤能力明顯降低。通過機(jī)制探索,觀察到IR-780在A549/DR細(xì)胞