DATS逆轉(zhuǎn)人類骨肉瘤多藥耐藥株耐藥及對類腫瘤干細胞作用的初步研究.pdf

1、研究背景：骨肉瘤是骨外科常見于青少年患者的惡性腫瘤，雖然近年來在外科手術(shù)以及新輔助化療上取得了很大進展，但死亡率仍很高。骨肉瘤易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及患者對化療藥物的原發(fā)或繼發(fā)耐藥是導(dǎo)致治療失敗的主要原因。盡管臨床已開發(fā)出多種針對腫瘤耐藥的藥物，但臨床療效仍不滿意，腫瘤干細胞假說為探尋骨肉瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移及耐藥機制，尋找有效治療藥物指明了方向。 腫瘤干細胞（Tumor stem cells）的發(fā)現(xiàn)為揭開腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移耐藥機制，尋找腫

2、瘤預(yù)防治療的方法等展示出廣闊的前景。早在上世紀中葉，科學(xué)家們從惡性畸胎瘤與胎兒組織的相似性，特別是癌組織與胚胎組織相似的多向潛能分化性，認識到二者可能密切相關(guān)。近年來的研究表明，在白血病以及部分實體瘤中（如乳腺癌、腦瘤等），只有一小部分腫瘤細胞具有無限增殖能力，并可形成新的腫瘤灶，這種細胞被認為是腫瘤干細胞。當(dāng)前所指的腫瘤細胞的異質(zhì)性不僅包括腫瘤內(nèi)細胞的異形性，對化療放療反應(yīng)的差異以及侵襲和轉(zhuǎn)移能力的不同，還包括腫瘤中存在有腫瘤干細胞和

3、非腫瘤干細胞。多數(shù)細胞沒有無限增殖和成瘤能力，只有腫瘤干細胞可自我更新產(chǎn)生新的腫瘤干細胞和無致瘤能力的腫瘤細胞。 腫瘤干細胞假說的提出是人類認識腫瘤發(fā)生機制的一大進步，它在理論上豐富了腫瘤發(fā)生的理論，在臨床實踐中提示人們殺傷腫瘤細胞（雖然它們也不斷地增殖）并不能治愈腫瘤，原因是腫瘤干細胞表達ABC轉(zhuǎn)運蛋白，參與多藥耐藥，并表達與干細胞共同的維持未分化的關(guān)鍵調(diào)控基因，如Sox2，Nanog，Oct4等，能夠保持并具有很強的自我更新

4、能力和抗凋亡能力，使得它們可逃逸當(dāng)前的標(biāo)準治療方法，成為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的“源泉”，因此，腫瘤干細胞被認為是腫瘤治療研究的新靶點，成為根治惡性腫瘤的希望所在。 尋找腫瘤干細胞的表面分子標(biāo)記，一直是研究的熱點。1997年，Bonnet等研究發(fā)現(xiàn)，人急性粒細胞白血病（acute myeloid leukemia， AML）中的CD34+CD38-亞群細胞，雖然僅占總數(shù)的0．2％，但是唯一可在免疫缺陷鼠具有成瘤性的細胞：2003年，Singh

5、 SK等發(fā)現(xiàn)腦腫瘤細胞在無血清培養(yǎng)中僅占總細胞數(shù)少數(shù)的CD133+群細胞可形成腫瘤細胞球，而CD133-群細胞不能形成，在第二年他們又發(fā)現(xiàn)CD133+群細胞移植到NOD/SCID鼠腦內(nèi)，可誘發(fā)腦腫瘤，但CD133-群細胞卻不能。2006年后，研究發(fā)現(xiàn)越來越多的腫瘤干細胞與CD133+群細胞有關(guān)，Suetsugua從肝癌細胞株Huh-7中，Ricci-Vitiani L和O'Brien CA分別在結(jié)腸癌組織中均分離出CD133+細胞，并證

6、明該群細胞為腫瘤干細胞。目前，骨肉瘤腫瘤干細胞尚無公認的表面標(biāo)記。 本研究對人類骨肉瘤及Saos-2細胞系中的腫瘤干細胞標(biāo)記物CD133表達進行研究，并用免疫磁珠細胞分選（MACS）方法分離Saos-2細胞系中的CD133陽性（CD133+）群細胞，對其分化、細胞周期、致瘤性以及與多藥耐藥相關(guān)和干細胞調(diào)控相關(guān)的MDR1、Sox2基因表達進行研究，以研究該群細胞的干細胞特性。使用逐步遞增氨甲喋呤（MTX）濃度方法誘導(dǎo)建立骨肉瘤多藥

7、耐藥系Saos-2/R，評估大蒜素（DATS）逆轉(zhuǎn)骨肉瘤耐藥的能力，并研究DATS逆轉(zhuǎn)耐藥后，培養(yǎng)基中MTX對Saos-2/R中腫瘤干細胞標(biāo)記物CD133表達百分率的影響。 目的：檢測腫瘤干細胞的表面分子標(biāo)記CD133在骨肉瘤組織細胞中的表達，分析骨肉瘤細胞系Saos-2中CD133+群細胞的干細胞特性。以Saos-2為母本，誘導(dǎo)建立骨肉瘤耐藥細胞系，研究大蒜素（DATS）逆轉(zhuǎn)骨肉瘤耐藥的潛力，并研究逆轉(zhuǎn)耐藥前后，對骨肉瘤腫瘤干

8、細胞群的影響。 方法：免疫組化研究CD133的表達：取自本院病理科的骨肉瘤常規(guī)石蠟包埋組織蠟塊標(biāo)本55例，其中骨旁骨肉瘤4例，纖維母細胞型骨肉瘤13例，軟骨母細胞型骨肉瘤12例，骨母細胞型骨肉瘤26例，切成3μm的組織切片備用。取Saos-2細胞系對數(shù)增長期細胞，傳代于放置有消毒后蓋玻片的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24h制備細胞爬片，使用70％乙醇固定20分鐘備用。CD133表達流式細胞儀分析：分析對數(shù)生長期的骨肉瘤細胞系Saos-2細胞的

9、CD133表達百分率。分離去除死細胞后，使細胞與CD133-PE抗體結(jié)合，上機檢測CD133表達百分比率。CD133+ Saos-2細胞分化研究：檢測CD133陽性細胞加入完全培養(yǎng)基前后的細胞周期及CD133百分率變化；收集細胞后，按照操作手冊，MACS去除死細胞，然后同樣用MACS方法分離CD133+群細胞，流式細胞分析該群細胞在加入全培養(yǎng)基前的第0天，以及加入全培養(yǎng)基后第3及10天的CD133陽性細胞群的百分率的變化，并以Saos-

10、2細胞做對照，分析第0天及第10天的細胞周期變化。CD133+/-群細胞MDR1，Sox2基因表達Real-time PCR分析：使用Real-time PCR分析CD133+群細胞涉及多藥耐藥及干細胞分化調(diào)控的關(guān)鍵基因MDR1、Sox2的表達情況；收集細胞，按照操作步驟去除死細胞，分選出CD133+/-群細胞，按照步驟行RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄，并行Real-time PCR分析。CD133+/-群細胞平板克隆形成實驗：細胞平板克隆形成實驗

11、檢測CD133+/-群的細胞克隆形成能力，分析其致瘤性差別；收集細胞后，按照操作手冊，MACS去除死細胞，然后MACS方法分離CD133+/-群細胞，將細胞懸液做倍數(shù)稀釋，按每皿50、100、200個細胞梯度密度，分別接種于含10ml預(yù)溫37℃培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，晃動培養(yǎng)皿使細胞分散均勻，將平皿移入培養(yǎng)箱中，在37℃，5％CO2及飽和濕度環(huán)境下，靜止培養(yǎng)3周，將平皿放置在顯微鏡下，肉眼直接計數(shù)克隆數(shù)，按照公式：克隆形成率（％）=克隆數(shù)/接

12、種細胞數(shù)×100，計算克隆形成率。 使用氨甲喋呤（MTX）濃度遞增法誘導(dǎo)培養(yǎng)Saos-2細胞系，使Saos-2逐漸產(chǎn)生耐藥性，命名為Saos-2/R，使用RT-PCR及Western blotting方法研究其P-gp（MDR1）的表達情況；使用MTT法驗證Saos-2/R對多種化療藥物的藥物敏感性變化，確定其是否產(chǎn)生多藥耐藥；DATS逆轉(zhuǎn)耐藥研究：應(yīng)用含梯度濃度的DATS的完全培養(yǎng)基孵育Saos-2/R48h，RT-PCR及W

13、estern blotting方法檢測Saos-2/R的P-gp（MDR1）表達變化，分析能夠下調(diào)P-gp（MDR1）表達的最低DATS逆轉(zhuǎn)濃度；MTT藥敏實驗檢測DATS作用后，Saos-2/R對不同化療藥物敏感性的變化。DATS逆轉(zhuǎn)耐藥后對CD133+群細胞的影響：使用含有最低逆轉(zhuǎn)濃度的DATS及梯度濃度MTX的完全培養(yǎng)基孵育Saos-2/R細胞48h，并與不含DATS，但含有同樣梯度濃度MTX完全培養(yǎng)基孵育的Saos-2/R細胞做

14、對照，流式細胞儀分析梯度濃度的化療藥物MTX對Saos-2/R中的CD133+群細胞所占比例的影響。 結(jié)論：骨肉瘤Saos-2細胞系中的CD133+群細胞具有少量、處于靜止期、分化增殖潛能特點，并表達干細胞關(guān)鍵調(diào)控基因及耐藥相關(guān)基因等腫瘤干細胞的特征，我們稱其為“類腫瘤干細胞”。DATS可有效下調(diào)P-gp（MDR1）的表達并逆轉(zhuǎn)耐藥，是有應(yīng)用潛力的逆轉(zhuǎn)骨肉瘤P-gp介導(dǎo)多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)劑。經(jīng)過DATS逆轉(zhuǎn)耐藥后的Saos-2/R中