三甲氧基二苯乙烯及其對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的抗腫瘤作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、肺癌是我國(guó)發(fā)病率較高的惡性腫瘤，在惡性腫瘤死亡的前列，其中80％-85％為非小細(xì)胞肺癌，因此，探討肺癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的機(jī)制成為目前研究的熱點(diǎn)。目前NSCLC的主要治療包括手術(shù)、化療、放療和分子靶向等綜合性治療。大多數(shù)NSCLC患者就診時(shí)已屬晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，化療成為最主要的抗腫瘤治療。白藜蘆醇(3，4'，5-三羥基-反-均二苯代乙烯)是一種由植物合成的應(yīng)對(duì)抗外來病原的多酚類化合物，已在多種植物中被發(fā)現(xiàn)。葡萄皮和紅葡萄酒中白

2、藜蘆醇的含量較高，而白葡萄酒中的含量極低。因此，研究者認(rèn)為白藜蘆醇是“法國(guó)悖論”現(xiàn)象(盡管法國(guó)人同其他發(fā)達(dá)國(guó)家的居民一樣，攝取了大量的高脂肪、高蛋白、高熱量的食物，但他們的心血管病發(fā)病率卻比其他發(fā)達(dá)國(guó)家低得多)發(fā)生的一種關(guān)鍵物質(zhì)。研究顯示，白藜蘆醇具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制血小板聚集、清除自由基、抗炎、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性和藥理作用。雖然白藜蘆醇抗腫瘤的作用近年來已經(jīng)成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，但是目前國(guó)內(nèi)外尚無白藜蘆醇在體內(nèi)、體外環(huán)境下抗腫瘤活性

3、的系統(tǒng)性研究報(bào)道，并且對(duì)于其抗腫瘤的機(jī)制也存在著多種觀點(diǎn)。白藜蘆醇衍生物和類似物(其中包括羥基類似物及甲基化和酯類衍生物等)與白藜蘆醇一樣具有多種生理藥理活性，其中有些化合物的活性、選擇性及穩(wěn)定性均要強(qiáng)于白藜蘆醇，故備受關(guān)注，成為近些年的研究熱點(diǎn)。為了全面了解白藜蘆醇的抗腫瘤活性，同時(shí)深入揭示其抗腫瘤作用的機(jī)制，進(jìn)行了本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。在一些惡性腫瘤不僅發(fā)現(xiàn)NF-κ B/Rel基因結(jié)構(gòu)的改變，而且發(fā)現(xiàn)其表達(dá)及活化水平的異常。大量的研究表明，NF

4、-κ B作為轉(zhuǎn)錄因子Rel家族的重要成員，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、胚胎及細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)展、炎癥和腫瘤的形成中起著重要的作用。
　　 為了確定三甲氧基二苯乙烯是否有抗非小細(xì)胞肺癌效應(yīng)，本研究用三甲氧基二苯乙烯作用于A549細(xì)胞株，觀察三甲氧基二苯乙烯對(duì)A549細(xì)胞是否具有增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)和分化誘導(dǎo)作用；并對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 第一章、三甲氧基二苯乙烯的結(jié)構(gòu)鑒定
　　 目的：對(duì)本實(shí)驗(yàn)藥物TMS進(jìn)行結(jié)

5、構(gòu)鑒定。
　　 方法：用紫外吸收光譜檢測(cè)、紅外吸收光譜檢測(cè)、1H-NMR譜檢測(cè)、13C-NMR圖譜檢測(cè)、質(zhì)譜檢測(cè)等方法對(duì)TMS進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
　　 結(jié)果：TMS的紫外吸收?qǐng)D譜為λmax(MeOH)：318nm，306.2nm，217.8nm，紅外光譜解析為IR v KBrmax(cm-1)：2999，2935，2836，1591，1511，1456，1H-NMR譜解析顯示結(jié)構(gòu)含有3個(gè)甲氧基，13C-NMR圖譜解析為17個(gè)

6、碳信號(hào)，并且其結(jié)構(gòu)中含有對(duì)稱的結(jié)構(gòu)片段。質(zhì)譜圖譜解析為ESI-MSm/z：271[M+H]+，256[M+H-CH3]+，241[256-CH3]+，表明分子量為270，推測(cè)分子式為C17H18O3，結(jié)構(gòu)中含有甲基。樣品元素分析得分子結(jié)構(gòu)式可用C17H18O3表示，結(jié)構(gòu)式為()，因此可確定化合物為反-3，4’，5-三甲氧基二苯乙烯。
　　 結(jié)論：TMS的分子結(jié)構(gòu)式可用C17H18O3表示，結(jié)構(gòu)式為()是反-3，4’，5-三甲氧基

7、二苯乙烯。
　　 第二章、三甲氧基二苯乙烯對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)
　　 目的：觀察三甲氧基二苯乙烯對(duì)A549細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響。
　　 方法：用MTT試驗(yàn)、集落形成抑制試驗(yàn)A549細(xì)胞增殖能力，觀察不同濃度的三甲氧基二苯乙烯對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制率、集落形成的影響。
　　 結(jié)果：(1)三甲氧基二苯乙烯以濃度依賴性方式有效地抑制A549細(xì)胞增殖，三甲氧基二苯乙烯抑制 A549細(xì)胞活力的I

8、C50為8.6μ mol/L；(2)三甲氧基二苯乙烯能顯著抑制A549細(xì)胞集落形成，并呈量效關(guān)系；
　　 結(jié)論：三甲氧基二苯乙烯能夠有效地抑制A549細(xì)胞增殖，并呈藥物濃度和時(shí)間依賴性。
　　 第三章、三甲氧基二苯乙烯對(duì)A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)
　　 目的：確定三甲氧基二苯乙烯能否誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。
　　 方法：用不同濃度的三甲氧基二苯乙烯作用于A549，采用Hochest33258染色法檢測(cè)凋亡細(xì)

9、胞的百分率；用Western印跡檢測(cè)三甲氧基二苯乙烯干預(yù)后的A549細(xì)胞Caspase-3蛋白質(zhì)表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)Hochest33258染色法證明三甲氧基二苯乙烯能以濃度依賴性方式誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡；(2)三甲氧基二苯乙烯誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡伴有Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)和裂解激活。
　　 結(jié)論：三甲氧基二苯乙烯能以濃度依賴性方式誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡；其誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制與Caspase-3蛋

10、白表達(dá)上調(diào)和裂解激活有關(guān)。
　　 第四章、三甲氧基二苯乙烯對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)的分子機(jī)制
　　 目的：觀察三甲氧基二苯乙烯作用下A549細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)過程中NF-κ B、STAT3、STAT5b、及JAK2等增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化及NF-κ B細(xì)胞內(nèi)分布，部分揭示三甲氧基二苯乙烯抗A549細(xì)胞作用的分子機(jī)制。
　　 方法：(1)用Western blot分析三甲氧基二苯乙烯作用下

11、A549細(xì)胞NF-K B、I K B、STAT3、STAT5b、JAK2蛋白質(zhì)表達(dá)水平，(2)用間接免疫熒光技術(shù)觀察NF-κ B在三甲氧基二苯乙烯干預(yù)的A549細(xì)胞中的定位及變化。
　　 結(jié)果：三甲氧基二苯乙烯能以濃度依賴性方式抑制A549細(xì)胞NF-κ B、STAT3、STAT5b、蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，可上調(diào)I K B蛋白質(zhì)表達(dá)，但對(duì)JAK2蛋白無明顯影響；NF-κ B主要分布于細(xì)胞胞漿中。
　　 結(jié)論：三甲氧基二苯乙烯的