bFGF-PLGA緩釋微球?qū)ν孟リP(guān)節(jié)軟骨不同面積缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：(1)在體外觀察自行研制的bFGF/聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)緩釋微球?qū)撬杌|(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的生物學(xué)特性的影響，為其體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。(2)建立不同面積的兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型，應(yīng)用關(guān)節(jié)內(nèi)注射bFGF緩釋微球的微創(chuàng)方法，觀察自行研制的bFGF/PLGA緩釋微球?qū)Σ煌娣e的兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的作用。(3)對(duì)于應(yīng)用bFGF/PLGA緩釋微球不能修復(fù)的面積，我們將微球與Ⅱ型膠原海綿聯(lián)合應(yīng)用，觀察修復(fù)效果。通過

2、上述實(shí)驗(yàn)為臨床應(yīng)用bFGF/PLGA緩釋微球修復(fù)大面積關(guān)節(jié)軟骨缺損作前期研究。 方法：1.體外實(shí)驗(yàn)：(1)在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)下，不加bFGF或?qū)⒂坞xbFGF或bFGF/PLGA緩釋微球加入第二代兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液中，用細(xì)胞計(jì)數(shù)法、四甲基偶氮唑鹽微量反應(yīng)比色法(MTT法)、流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞在第1，2，4，7及10天增殖的狀況，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。(2)檢測在特定的相同的成軟骨誘導(dǎo)分化條件下，不加bFGF或加入游離bFGF或bFG

3、F/PLGA緩釋微球?qū)φT導(dǎo)BMSCs成軟骨分化后，蛋白多糖和Ⅱ型膠原生成的影響。 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：(1)選擇健康成年新西蘭大白兔48只，按建立的骨-軟骨缺損模型面積的大小及治療方法的不同分成A組5x5x3mm(游離對(duì)照組)、B組5x5x3mm、C組5x7x3mm、D組5x9x3mm、四個(gè)處理組。按分組關(guān)節(jié)內(nèi)分別注入游離bFGF和bFGF/PLGA緩釋微球。術(shù)后4周、8周、12周收集標(biāo)本，通過大體觀察、組織學(xué)評(píng)分、免疫組化和原位雜交

4、檢測Ⅱ型膠原、蛋白多糖的定量檢測，分析不同處理組軟骨修復(fù)的情況。(2)對(duì)于微球不能修復(fù)的缺損組，將微球與Ⅱ型膠原海綿聯(lián)合應(yīng)用或單獨(dú)應(yīng)用Ⅱ型膠原海綿進(jìn)行治療，觀察修復(fù)效果。 結(jié)果：1.體外實(shí)驗(yàn)：(1)培養(yǎng)1d后，三組細(xì)胞計(jì)數(shù)、吸光度(OD)值差異均無顯著性意義；2d時(shí)，bFGF組的BMSCs細(xì)胞數(shù)高于其余二組，差異有顯著性意義(q檢驗(yàn)，P＜0.05)；4d時(shí)，各組MSCs細(xì)胞依次為：PLGA微球組＞bFGF組＞空白對(duì)照組，各組間差

5、異均有顯著性意義(q檢驗(yàn)，P＜0.05)；培養(yǎng)7d、10d時(shí)，微球組與上述兩組仍有顯著性差異。流式細(xì)胞儀檢測顯示，培養(yǎng)2d時(shí)，bFGF組的增殖指數(shù)最高，4d后PLGA微球組增殖指數(shù)最高。(2)在第7天，Ⅱ型膠原免疫組化陽性，游離組與微球組之間沒有顯著性差異(P＞0.05)，第14天，3組均有顯著性差異(P＜0.05)，微球組＞游離組＞空白組。 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：(1)在游離bFGF治療的A組，12周后軟骨層和軟骨下骨均未能得到修復(fù)，

6、已填充的修復(fù)組織組織學(xué)檢測多為纖維組織，蛋白多糖和Ⅱ型膠原的含量均明顯低于微球組，組織學(xué)評(píng)分低于各微球治療組。在微球治療組中，B組(5x5x3mm)所有缺損在術(shù)后4周，即得到完全填充，填充細(xì)胞以圓形類軟骨細(xì)胞和紡錘形的未分化的間充質(zhì)細(xì)胞為主，并且在術(shù)后8-12周中，修復(fù)組織的細(xì)胞學(xué)形態(tài)逐漸接近正常透明軟骨細(xì)胞。術(shù)后12周時(shí)，修復(fù)組織的甲苯胺藍(lán)染色、蛋白多糖含量定量檢測和Ⅱ型膠原免疫組化、原位雜交檢測顯示其基質(zhì)成分如蛋白多糖和Ⅱ型膠原等，

7、明顯高于其它各組；而在其它各微球治療組，隨缺損面積的增大，缺損填充度、蛋白多糖和Ⅱ型膠原含量呈逐漸下降趨勢，修復(fù)的軟骨層較正常軟骨薄且以纖維軟骨為主。12周時(shí)，B組的組織學(xué)評(píng)分明顯優(yōu)于C、D組。(2)術(shù)后12周，微球聯(lián)合應(yīng)用Ⅱ型膠原海綿組的缺損以類透明軟骨修復(fù)，組織學(xué)評(píng)分優(yōu)于單獨(dú)海綿治療組，有顯著性差異。 結(jié)論：(1)微球通過較長時(shí)間持續(xù)釋放活性bFGF，能長期顯著地促進(jìn)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。在特定的成軟骨誘導(dǎo)分化條件下可促

8、進(jìn)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化并促進(jìn)其蛋白多糖和Ⅱ型膠原生成，優(yōu)于游離bFGF誘導(dǎo)組，差異有顯著性。 (2)關(guān)節(jié)內(nèi)注射PLGA緩釋微球的微創(chuàng)方法，能有效促進(jìn)5x5x3mm兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)。其效果與游離bFGF組和更大面積組相比有顯著性差異。PLGA緩釋微球?qū)ν藐P(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)有一定面積的限制，對(duì)5x5x3mm大小的缺損，在12周內(nèi)可完成對(duì)其修復(fù)，修復(fù)組織為成熟的類透明軟骨，表現(xiàn)為圓形軟骨樣細(xì)胞和蛋白多糖、Ⅱ型膠原為主的細(xì)胞外基