結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體輔助因子PafC在氟喹諾酮類藥物莫西沙星耐受中的作用.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis,簡(jiǎn)稱結(jié)核菌）引起的全球性感染性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告，全球三分之一的人感染過結(jié)核菌，而僅在2012年結(jié)核病患者就有860萬(wàn)，全球結(jié)核病死亡人數(shù)高達(dá)130萬(wàn)。結(jié)核病疫情如此嚴(yán)重，除了其致病菌結(jié)核菌的獨(dú)特致病特性外，多重耐藥結(jié)核(multi-drugresistant tuberculosis, MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核(extensively drug r

2、esistanttuberculosis，XDR-TB)的出現(xiàn)以及和結(jié)核菌與人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus，HIV)共感染，使得結(jié)核病疫情更加難以控制。
　　目前治療結(jié)核病的一線藥物包括異煙肼(Isoniazid，INH)、利福平(Rifampicin，RIF)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide，PZA)以及乙胺丁醇(Ethambutol，EMB)對(duì)MDR-TB和XDR-TB患者無(wú)效。因

3、此二線抗結(jié)核藥物氨基糖苷類抗生素、多肽類抗生素和氟喹諾酮類抗生素作為MDR-TB和XDR-TB患者的主要藥物。其中氟喹諾酮藥物因具備低毒副作用和大量的衍生物的特點(diǎn)而倍受重視。然而，針對(duì)氟喹諾酮藥物的耐藥菌的不斷出現(xiàn)使得結(jié)核病防控雪上加霜。
　　因此，我們?cè)噲D尋找分枝桿菌耐氟喹諾酮藥物的新機(jī)制，將相關(guān)基因作為潛在的氟喹諾酮藥物增效劑靶點(diǎn)，為解決MDR-TB和XDR-TB的藥物開發(fā)提供基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)之前的工作初篩到了一株對(duì)莫西沙星超敏感

4、的恥垢分枝桿菌(Mycobacteirum smegmatis)突變株M371，并鑒定了轉(zhuǎn)座子插入的位點(diǎn)。本課題將進(jìn)一步驗(yàn)證突變株M371超敏感的表型及其機(jī)制，并初步探索突變株在脅迫反應(yīng)中的作用。
　　首先，采用8倍野生型恥垢分枝桿菌最小抑菌濃度(minimum inhibitoryconcentration，MIC)的莫西沙星處理恥垢分枝桿菌野生型和突變株M371，記錄處理不同時(shí)間后的菌落形成單位(colony-forming

5、unit，CFU)，計(jì)算存活率并作殺菌曲線，驗(yàn)證突變株M371的莫西沙星超敏感表型。然后，為了研究基因MSMEG_3888在恥垢分枝桿菌在天然耐受(intrinsic resistance)莫西沙星中的作用，構(gòu)建突變株M371的回補(bǔ)菌株。而MSMEG_3888結(jié)核菌H37Rv中的對(duì)應(yīng)基因?yàn)镽v2095c。將基因Rv2095c克隆并連接到穿梭質(zhì)粒pALACE上，并將重組質(zhì)粒pALACE-Rv2095c電轉(zhuǎn)化入突變株M371，獲得回補(bǔ)菌株。

6、并采用Western-blot檢測(cè)回補(bǔ)菌株中基因Rv2095c的表達(dá)和MIC實(shí)驗(yàn)判斷對(duì)莫西沙星的敏感性。最后，探索突變株M371、野生株和回補(bǔ)菌株在表面性質(zhì)方面的差異，并以過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)及十二烷基磺酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfonate，SDS）模擬肺泡的環(huán)境來(lái)研究三株菌的脅迫反應(yīng)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:恥垢分枝桿菌突變株M371的經(jīng)莫西沙星處理存活率比野生型低，為莫西沙星超

7、敏感表型。通過菌液PCR驗(yàn)證和基因測(cè)序，證明了成功構(gòu)建了回補(bǔ)菌株M371-pALACE-Rv2095c。Western-blot驗(yàn)證了Rv2095c異源表達(dá)成功，并且回補(bǔ)菌株與野生型具有相同的耐受能力。由此證明了基因MSMEG_3888參與對(duì)莫西沙星的本底耐受。在生物表面性質(zhì)方面，恥垢分枝桿菌野生型、突變株M371和回補(bǔ)菌株，三者在單菌落形態(tài)和滑動(dòng)能力方面無(wú)明顯差異;但在脂質(zhì)系數(shù)方面差異明顯，突變株較野生型明顯下降。三者在SDS耐受水平